2016, Vol. 14
高等植物中类胡萝卜素的合成途径理论已经成熟，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)是类胡萝卜素最直接的前体物质[1]。GGPS催化3，3-二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)与异戊烯基焦磷酸(IPP)合成GGPP,两个GGPP分子通过八氢番茄红素合成酶缩合形成八氢番茄红素。GGPS基因最早从辣椒[2]中分离得出,之后又在番茄[3]、丹参[4]、烟草[5]、银杏[6]等植物中分离得到。
近年来，GGPS基因在功能研究上取得了一些进展。在一些植物中发现GGPS对类胡萝卜素的合成积累具有极为重要的作用[3, 7]。但在啤酒酵母中GGPS基因过表达，会导致β-胡萝卜素含量显著增加[8]。在法夫酵母和卷枝毛霉中，GGPS过表达也能显著提高类胡萝卜素产量[9-10]。在cDNA文库中，通过使用该酶抗体完成筛选，从而得到GGPScDNA[11]。另外研究还发现，GGPS对于调节碳流还有着重要的作用[12]。在植物体中，GGPS经常是多基因家族化合物。其表达的蛋白质存在于不同的亚细胞结构中[13]。本课题共选择了以下9种不同科且已知GGPS基因序列的物种：银杏(银杏科)、烟草(茄科)、长春花(夹竹桃科)、丹参(唇形科)、蔷薇(蔷薇科)、万寿菊(菊科)、甘薯(薯蓣科)、茉莉(木犀科)、加拿大红豆杉(红豆杉科)。对GGPS的理化性质、核酸序列、蛋白质结构功能等进行详细的分析，研究其进化关系，进而更深层次的了解GGPS的性质，为该基因对植物的生长调控所产生的影响提供更可靠的理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料本实验数据来源于NCBI核酸和蛋白质数据库中已经注册的GGPS核酸及相应的氨基酸序列，包括银杏(Ginkgobiloba ,AAQ72786.1)、万寿菊(Tageteserecta,AAG10424.1)、甘薯(Ipomoea batatas,ACF37217.1)、茉莉(Jasminum sambac,AIY24421.1)、加拿大红豆杉(Taxus canadensis,AAD16018.1)、烟草(Nicotiana tabacum,ADD49734.1)、长春花(Catharanthus roseus,AGL91648.1)、丹参(Salvia miltiorrhiza,ACR19637.1)、蔷薇(Cistus creticus,AAM21639.1)、甜菊(Stevia rebaudiana,ABD92926.2)、蓖麻(Ricinus communis,XP_002531191.1)、麻疯树(Jatropha curcas,ADD82422.1)、橡胶树(Hevea brasiliensis,BAF98302.1)。
1.2 方法GGPS氨基酸序列的理化性质的分析使用Expasy软件中的ProtParam在线工具；ORF的预测分析使用NCBI数据库中ORF查询工具；使用SignalP 4.1在线工具分析GGPS是否含有信号肽；通过NetPhos 2.0 和NetNGlyc 1.0在线工具分析糖基化和磷酸化位点；通过NCBI数据库中的CDD工具对GGPS的保守结构域进行预测分析；通过SOPMA软件可以预测GGPS二级结构,通过SWISS-MODEL在线分析其三级结构；通过Clustal X采用渐进比较算法进行多序列比对[14]；通过MEGA建树工具构建进化树。
2 结果和分析 2.1 GGPS氨基酸序列理化性质分析使用在线分析软件ProtParam分析9种植物GGPS氨基酸序列的理化性质(见表 1)。
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表 1 GGPS的氨基酸组成及理化性质分析 Table 1 Physical and chemical characteristics of GGPS amino acid in different plants |
由表可知，所选植物GGPS序列在氨基酸数目、预测分子量、Ip都表现出一致性，他们的基因序列全长在1 000 bp到2 000 bp之间；氨基酸数目除银杏和加拿大红豆杉在390左右外，其余的在365左右；Ip值除甘薯6.84以外，其余均小于6，不稳定指数40左右，脂肪指数在94左右；Ala、Leu、Glu、Lys、Gly是所选植物GGPS序列中含量最为丰富的氨基酸，而Pyl和Sec为所选植物中都不存在的氨基酸。
2.2 GGPS核酸序列ORF分析通过ORF Finder在线软件分析9种植物GGPS核酸序列的开放阅读框(见表 2)。
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表 2 不同植物GGPS核酸序列ORF分析 Table 2 Nucleic acid sequence analysis of GGPS ORF in different plants |
在线分析软件ORF Finder提供了六组参考数据，包含了不同阅读顺序可能出现的情况。由于GGPS氨基酸序列长度已经知道，所以每一个ORF基本都对应着相应编码蛋白质的大小，结果显示除了丹参以外其余植物GGPS的开放阅读框大小均在1 100 bp左右，而丹参可能由于蛋白编辑剪切不同，所以稍有差异。从这些也可以看出，GGPS序列存在一定的保守性。
2.3 蛋白质信号肽的预测分析使用SignalP 4.1 Server在线工具以银杏为研究对象对所选GGPS未知氨基酸序列中包含的信号肽进行分析(见图 1)。
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图 1 银杏GGPS的信号肽分析结果 Figure 1 Signal peptide analysis result of Ginkgo GGPS |
结果表明，银杏的GGPS蛋白序列都不存在信号肽。且由图可以看出，S值和Y值均比较低，因此可以推测以上植物的GGPS蛋白通过核糖体合成之后，生成的蛋白质属于非分泌蛋白。通过对另外8种植物分析可得到相近的结果。
2.4 糖基化和磷酸化位点分析使用NetNGlyc 1.0以万寿菊为例对所选GGPS序列的糖基化位点进行分析(见图 2)。
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图 2 万寿菊GGPS氨基酸序列的糖基化分析 Figure 2 Glycosylation prediction of ginkgo GGPS amino acid sequence |
如图所示，红色横线(Threshold)表示阈值，阈值设定为0.5，大于阈值的蓝色竖线(Potential)表示此点有被糖基化的可能。万寿菊GGPS氨基酸序列糖基化分析结果显示，在5和24位点的天冬酰胺处存在蓝色竖线，值分别为0.782 8和0.715 6，因此这两处可能被糖基化。对其他植物GGPS氨基酸序列的糖基化预测分析得出，除银杏、茉莉和红豆杉没有糖基化位点外，其余植物GGPS蛋白均存在不同程度的糖基化。
使用NetPhos 2.0在线工具以银杏为研究对象分别预测了丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸3种不同的磷酸化位点(见图 3)。
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图 3 银杏GGPS氨基酸序列的磷酸化位点预测* Figure 3 Phosphorylation site prediction of ginkgo GGPS amino acid sequence 注：*彩图见电子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2016年第3期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.03.01)。 |
结果表明，总共有24个位点被磷酸化，其中有13个丝氨酸磷酸化位点(分别是第24、33、66、84、109、222、224、229、258、295、326、339和369位)、9个苏氨酸磷酸化位点(分别是第44、88、120、144、203、223、262、302和325位)以及2个酪氨酸磷酸化位点(分别是第53和370位)，在以上24个磷酸化位点中S369、S258、S295预测分值最高，均在0.990以上。通过对另外8种植物GGPS氨基酸序列的分析，可以得到同样的结果。
2.5 蛋白质二级结构预测分析以银杏为研究对象，使用SOPMA在线工具分析GGPS氨基酸序列的二级结构(见图 4)。
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图 4 银杏GGPS氨基酸序列的二级结构预测* Figure 4 Secondary structure prediction of ginkgo GGPS amino acid sequence 注：*彩图见电子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2016年第3期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.03.01)。 |
由图可知，在银杏多肽链中二级结构中α-螺旋(蓝色线*)在链中出现的概率是51.92%、无规卷曲(紫色线*)在链中出现的概率是26.09%、延伸链(红色线*)在链中出现的概率是12.02%、β-转角(绿色线*)在链中出现的概率是9.97%，可以看出银杏GGPS二级结构中没有β-折叠结构。可见α-螺旋是GGPS多肽链中大量存在的结构元件而散布于整个肽链中。另外8种植物的GGPS二级结构中也有类似的情况。
2.6 保守结构域的预测和分析使用NCBI中的CDD工具以银杏为例进行蛋白质结构域的预测分析(见图 5)。
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图 5 银杏GGPS保守结构域分析 Figure 5 conserved domains analysis of Ginkgo GGPS |
由NCBI中CDD工具中的详细解释可以得出，银杏GGPS氨基酸序列有一个异戊二烯合酶C1超家族，总共有六个不同的保守结构域，分别是底物结合保守结构域，结合Mg2+的结构域，活性位点残基结合结构域，决定链长度的保守结构域，催化残基的保守结构域和富含天冬氨酸的保守结构域。
2.7 蛋白质三级结构预测分析使用Swiss-Model对九个科植物GGPS氨基酸序列的三级结构进行预测分析(见图 6)。
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图 6 不同植物GGPS氨基酸序列的三级结构预测 Figure 6 Tertiary structure prediction of GGPS in different plants |
通过上面九个三级结构图可以看出，这些植物GGPS蛋白的三级结构极为相似，这同它们核苷酸序列与氨基酸序列的相似性有很大关系，相似的空间结构往往具有相似的功能，同时也可以看出GGPS在进化过程中是相对保守的。
2.8 核苷酸多序列比对从前面对九个不同科植物GGPS序列的分析可以看出，它们的序列相似性相对较高，理化性质差异也不是很大，因此将进一步从序列上分析它们的同源性，为这些植物构建进化树，从而较直观的反映出它们之间的亲缘关系。使用Clustal X软件对九个不同科植物进行多序列比对(见图 7)。
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图 7 不同植物GGPS的氨基酸多序列对比分析* Figure 7 Multiple sequence alignment of GGPS in different plants 注：*彩图见电子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2016年第3期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.03.01 )。 |
通过Clustal软件对九个科植物GGPS氨基酸序列进行比对的结果，可以明显的看到这些序列在很大程度上都是相似的，只有少部分存在差异，因此可以得知GGPS在进化过程中是相对保守的。
2.9 GGPS进化树的构建对九种植物的GGPS氨基酸序列和一些相同科的植物如甜菊、蓖麻、麻疯树、橡胶树使用MEGA4.0软件进行分子系统演化分析，获得GGPS核苷酸序列的分子进化树，更进一步地分析它们的亲缘进化关系(见图 8)。从图中可看出13种植物GGPS氨基酸序列明显被分为三大类，万寿菊和甜菊同属于菊科因此亲缘关系最近，蓖麻和麻疯树同是大戟科，亲缘关系也很近，由于有九个不同的科所以进化树的小分支较多，而氨基酸序列和基因序列进化树在大体结构上是相似的，但其分类也有稍微差异，可能是由于在进化过程中某些核苷酸的变异导致其氨基酸发生变化，但结合其序列比对结果发现，总体上GGPS序列还是较为保守的。因此GPSS是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生物合成途径中一个相对保守的基因，可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要依据。
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图 8 不同植物GGPS的氨基酸序列分子进化分析 Figure 8 Phylogenetic tree analysis of GGPS in different plants |
本研究使用生物信息学的方法对来源不同植物GGPS的氨基酸序列进行了系统分析。试验结果表明，植物GPSS属于大分子蛋白；氨基酸序列理化性质分析显示植物GGPS 富含Ala和Leu；通过植物GGPS氨基酸序列进行比对的得知GGPS在进化过程中是相对保守的；将13种植物的GGPS进行分子进化分析，结果表明万寿菊和甜菊同属于菊科因此亲缘关系最近，蓖麻和麻疯树同是大戟科，亲缘关系也很近，由于有九个不同的科所以进化树的小分支较多，而氨基酸序列和基因序列进化树在大体结构上是相似的，但其分类也有稍微差异，可能是由于在进化过程中某些核苷酸的变异导致其氨基酸发生变化，但结合其序列比对结果发现，总体上GGPS序列还是较为保守的，因此可作为生物遗传分化和分子进化研究中的重要依据；二级结构分析推测 α-螺旋是多肽链中的主要结构元件。该研究结果可为深入开展 GGPS 酶学特性的分子机理研究提供重要理论依据。
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