单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)，又称彗星实验，是一种快速并大通量的检测DNA损伤的方法。20世纪70年代末Rydberg和Johanson最早报道利用该方法直接定量检测单个细胞DNA损伤^[1]。首先将靶细胞包埋于低熔点琼脂糖中，利用裂解液裂解，在弱碱性解旋液作用下使DNA解螺旋，中和后，利用丫啶橙染色并用光度计测定单双链，对比检测DNA损伤情况。但最终因其操作难度问题，该方法未能广泛应用。

为了提升此方法的敏感性，1984年，Ostling和Johanson发展了微凝胶电泳技术，该方法与现在的SCGE方法较为接近。同样，首先将细胞加入到低熔点琼脂糖中，将凝胶固定在载玻片后在裂解液作用下裂解，然后在中性(后发展碱性)条件下进行电泳，若有DNA断裂片段，则其会向阳极移动，从而形成彗星尾巴，此DNA损伤程度与彗星尾长度成正相关。该方法从诞生之初已历经30多年，随着时间的推移，这种方法已得到改进，但现在仍没有完全标准化。

1 单细胞凝胶电泳原理

造成细胞DNA断裂的原因比较复杂。其中，化学介质，如氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)是极其重要的因素。一般地，细胞在氧自由基作用下，细胞内的DNA直接受到损伤，引起高级结构的变化，致使其超螺旋结构松散。SCGE方法首先利用细胞裂解液，破坏检测细胞细胞膜，从而使内部小分子的DNA及其他成分因膜破坏而进入凝胶，但细胞中的大分子核DNA会仍留在原位，核骨架会使其固定在原位。如果检测细胞DNA未出现损伤问题，结果图片会显示较为规则的圆形的荧光团，无拖尾现象，表明核DNA完整地停留在核基质中。若检测细胞DNA受到损伤，在碱性电泳液(pH > 13)的作用下，DNA由双链解螺旋变为单链，在电泳作用下，损伤细胞DNA的单链断裂并且会向阳极迁移，形成拖尾。同样，细胞核DNA受损伤程度越高，产生的断链及DNA碎片会越多，最后荧光检测得到的彗星尾越长和彗尾越亮^[2]。该实验最终通过荧光显微镜观察结果图片有无彗星及彗尾的亮度、长度、彗尾比例等，判断检测细胞DNA是否受到损伤及损伤程度。

2 单细胞凝胶电泳优劣

SCGE在分析细胞DNA损伤方面相对快速、简单和敏感。其能够结合其他DNA损伤相关技术，例如交联ALS，从而更全面地进行细胞遗传学分析。

与其他的遗传毒理学检测方法相比，SCGE主要存在以下优点：(1)数据可以以单细胞水平显示说明；(2)所需样本量少，只需要一小部分细胞；(3)适用范围广泛，几乎适用所有的真核细胞群；(4)测定结果敏感，操作简单，成本较低；(5)结果获得较为快速，若干小时可得到结果；(6)具有多种检测功能，结果图较为直观，易分析。

最近对SCGE研究发现，其不仅仅可以识别致癌物，而且可以测试细胞中DNA的损坏程度。在自然界中，有许多化学物质是致癌物质，但并不是每一种致癌物质都会造成DNA破碎，有些致癌物只会造成DNA损害，SCGE可以在细胞进行修补时，发现这一类的致癌物质，这是以往的测试都无法做到的。

尽管SCGE有许多优点，但目前该方法主要通过结果图片分析进行DNA损伤检测，并没有一个完全可靠的生物标记物确定DNA损伤。因此，一般需要与其他方法联用使结果更加明确。另一方面，使用SCGE方法的实验室很多，但实验不尽相同，这就导致的不同实验室SCGE分析结果之间的可比性较差。SCGE自诞生开始，其具体方法都在不断探索和进步，整个实验方法仍没有完全标准化，因其涉及领域较为广泛，所以，标准化较为困难。

3 单细胞凝胶电泳应用 3.1 遗传毒理学应用

SCGE可检测DNA交联、氧化性损伤与DNA切除修复缺陷等多种类型的DNA损伤，因此该方法是研究遗传毒理学极为适用的方法之一^[3]。

在遗传毒理学领域，大量的研究人员采用碱性SCGE来评估化学物质在体外或体内实验中的基因毒性。彗星实验可用于在体外研究中检测各种正常和转化的人类、动物和植物细胞。当然它同样适用于人类功能细胞，包括白细胞和淋巴细胞及其他组织细胞，如上皮细胞、生殖细胞、结肠细胞、胰岛细胞、腺癌细胞等。SCGE也能够检测不同的细胞系及不同类型的癌细胞，如结肠癌、膀胱前列腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等等^[4]。标准的体内碱性SCGE可以很容易地适应调查生殖器官的细胞。多研究表明，在生殖细胞诱变剂的风险评估方面，彗星试验方法具有明显优势^[5]。

SCGE在动物细胞DNA损伤及相关研究方面也卓有成效。因其所需实验样本少，任何组织及器官均能被用于检测，所以已有大量的检测工作被完成。其中，啮齿动物更加被频繁地检测，但其他动物，如狗、羊、蝌蚪和鱼同样能够被较好检测。SCGE方法已经应用于动物的多个器官和组织，包括血液、骨骼、大脑、胃肠粘膜、肾、肝、肺、鼻粘、卵巢、皮肤、脾脏和睾丸等^[6]。

Speit等使用SCGE的研究表明，当DNA链中出现一个修复通路出现问题，DNA整链都有可能出现严重受损^[7]。当前, 在检测出某种物质特别是化学物质对DNA修补的影响方面，除去SCGE方法，其他方法都不能准确地进行分析测定。目前只有彗星分析法能够精确地测出DNA修复功能^[8]，并及时发现致畸物质。彗星分析法还可用来确定某种物质是否是毒性物质, 并明确人体DNA损伤或修补受其影响的程度。可利用SCGE进行人体白细胞的体外实验，如果被测物质是有毒物质，那么DNA将出现损伤，而出现损伤的DNA在结果上会显示彗星形状^[9]。化学品测试在这一领域的数量迅速增加，至今已有大量化学物质进行了遗传毒理学方面的检测，如重金属、各类农药、亚硝胺等。

3.2 DNA损伤及细胞凋亡的研究应用

因为SCGE的特点，该方法几乎被用来评估任何类型的真核细胞的DNA修复能力及包括双、单链断裂的不同的DNA损伤情况。中性和碱性的SCGE可分别用于分析和评估单链及双链DNA的损伤修复。同样，该方法可用于检测电离辐射引起的单和双链断裂及细胞修复。

有研究采用碱性SCGE方法检测健康受试者在受辐射情况下，外周血淋巴细胞DNA损伤和修复的。该方法具有能够分析单个细胞的优势，能够明确DNA受损细胞分布及程度。同样，可以直接使用该方法对如紫外线辐射导致的不同程度的DNA链断裂进行化验检查。碱性SCGE可用来检测DNA切除修复、DNA合成抑制剂链终止剂的作用。也有实验用该方法试验各类酶治疗损伤DNA细胞的效果。

因为SCGE方法的高灵敏度，也被应用于研究凋亡的DNA片段。细胞凋亡是人体自我保护的一种形式，如果存在一个细胞DNA损伤过于严重，已经无法修补，凋亡程序就会触发。如果缺失细胞凋亡功能或细胞凋亡功能紊乱，那么DNA损伤细胞会继续复制，从而危及生物体全身。凋亡功能的丧失可能会导致癌症的发生。相比于其他方法，单细胞凝胶电泳技术能够更快速并且准确地检测到已丧失凋亡功能的细胞，也可以提供细胞自杀过程的早期资料^[10]，以上优点使该方法在研究细胞凋亡方面具有重要作用，出现凋亡现象的细胞DNA在结果图中会显示初期为严重的细胞拖尾现象，其尾部占有比重极高。SCGE方法还可通过计数统计等方法快速测定凋亡细胞的比例。

3.3 环境污染监测中的应用

随着科技发展，环境污染愈发严重，而且环境污染与生物细胞DNA损害关系密切，严重环境污染可能导致周围生物癌变，因此人们对环境污染监测越来越重视。环境污染中的生物、物理、化学因素都能导致细胞DNA损伤，引起基因突变和细胞癌变。所以判断细胞DNA是否出现损伤情况在环境监测方面尤为重要。SCGE能够检测不同生物不同细胞的不同类型的遗传毒性损伤情况。其具有利用少量细胞提供数据、结果敏感、实验快速、成本低、效率高等优点，因此彗星实验方法被广泛用于环境污染物的监测中。

在空气污染物方面，二氧化硫及飘尘是最主要的监测指标。SO₂ 能引起DNA损伤的出现，而且进一步研究分析二者存在一定的剂量效应关系。张爱华等^[11]用SCGE检测燃煤引起的砷中毒患者血细胞DNA的损伤情况，结果表明砷能引起人体血细胞DNA单链断裂。

大量研究报告表明SCGE在检测水生环境中极具潜力。过去的5年的研究发现，和其他常用的遗传生态毒理学生物标志物相比，在对水生生物遗传毒理检测更具敏感性^[12]。有研究使用SCGE检测利用工业用水所培养细胞的DNA损伤情况。由于其高灵敏度，SCGE已被广泛用于鱼和贻贝细胞的实验室标准检测中。SCGE也同样被利用于水质检测中^[13]。

近年来，SCGE，在评估暴露人群的DNA损伤方面已成为一个重要的工具。SCGE已作为首选方法适用于人群为基础的环境污染研究中。在对个体暴露于空气污染物、金属、农药、辐射等有害异物研究中，有研究利用SCGE检测废物回收站附近动物，发现其脑DNA损伤概率显著上升。利用碱性SCGE方法测定不同土壤样本中的蚯蚓DNA损伤情况从而作为土壤污染的指标。由于SCGE方法的方便操作，因此，DNA损伤的报告通常由该方法检测，SCGE的成功反映在过去30年，环境监测领域有越来越多的研究、报告使用其进行检测^[14]。

生产过程中同样会产生各类有毒物质。一般主要通过DNA损伤检测来确定这些物质是否具有致癌性或致突变性。生产中的某些物质可直接导致DNA断裂。而另一些物质则需在体内经代谢活化后会存在致癌性。王涛等^[15]利用体外活化系统，利用SCGE方法检测了黄曲霉毒素、苯并(a)芘等9种间接致突变物与DNA损伤程度的关系，其结果具有显著性。

由此可见，在环境监测中，用SCGE检测DNA损伤的应用范围极其广泛，其对环境污染物的影响检测尤为重要^[16]。

3.4 人群监测

SCGE可用于群体生物学检测，全美通讯网项目招募了近100名研究小组共享数据集。利用SCGE，通过其在生物监测研究中多样化的应用，检测人类的DNA损伤水平与环境和职业接触毒性药物，饮食和其他因素的关系^[17]。

SCGE能够应用于人群监测的主要原因是其所需样本数量少，只要明确年龄、工作环境等因素，只需要从研究对象获得少量细胞就能够进行研究。大量实验主要通过检测有核血细胞的DNA损伤来进行评价。有研究利用SCGE方法检测20岁人群淋巴细胞DNA损伤情况。研究调查200名健康人，利用碱性彗星方法检测DNA迁移的程度，发现吸烟者的血液淋巴细胞DNA受损率显著增加，且其中男性比率高于女性。

彗星分析法与其他分析法最显著的区别是SCGE可检测正常人群并明确修复情况。其能测出DNA损伤程度，其他测试法只能明确某一种物质是否会导致DNA损伤，却无法测出其损伤程度，更无法测出DNA修补的情况及速度^[18]。

3.5 临床诊断与治疗监测

利用中性SCGE可检测接受放射治疗的病人的肿瘤细胞及一般细胞的DNA损伤情况，该方法已在何杰金氏病、非霍奇金淋巴瘤、鳞状细胞癌或腺癌方面有所应用。由于该方法所需样本较少，所以只要少量血液或固体组织就能进行判断。采用碱性SCGE，可检测在辐照条件下乳腺癌的缺氧细胞数量，该方法在此条件下具有较高敏感性^[19]。同样，也有利用碱性彗星实验方法确定白内障晶状体上皮细胞DNA损伤。

在肿瘤研究方面，DNA损伤和DNA修复缺陷是癌症发生的分子基础。许多基础研究与临床研究，采用SCGE，来研究各种各样的肿瘤细胞对各类DNA损伤制剂的生物学效用，并得到重要的结果，使得肿瘤科学家得知最佳干预的时机。

在肿瘤放疗敏感性研究方面，由于肿瘤对于放疗反应是存在差异，预测肿瘤对于放疗的敏感性长期追求的目标，有多种因素可影响肿瘤的放疗效果，尚无一种方法来预测肿瘤对于放疗是否发生反应，而SCGE在目前被基础和临床肿瘤治疗学推崇的最最先进的技术。同样，在肿瘤化疗敏感性预测方面，由于肿瘤细胞对于各种化学药物的反应是存在极其大的差异，因此无论在肿瘤的治疗之前，尤其是在治疗的过程中，及时了解肿瘤治疗的进程，药量的大小，治疗方案选定，SCGE是国际治疗所推荐的方法。

利用SCGE检测DNA损伤的程度与治疗的结果的联系还有待建立。在未来，SCGE可能可以作为研究新药物和抗肿瘤之间的相互作用机制分析的重要方法。

3.6 高通量生物信息学研究的实验验证

生物信息学是一门收集、分析遗传数据并进行相关研究的学科，生物信息学特指数据库类的工作，其研究需要大量数据的支持。从某种角度而言，生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头的。

生物信息学是建立在分子生物学的基础上的，而SCGE方法在分子生物学上应用广泛。尤其在研究DNA损伤及修复的相关生物信息学方面，SCGE作用尤为显著。在研究动物、人体DNA损伤相关基因及其通路的信息学研究方面，SCGE对各类实验都能够起到验证作用。

4 单细胞凝胶电泳发展

Santos等人于1997年创立了彗星电泳和荧光原位杂交技术联用(Comet-FISH)^[20]。该方法是在原有SCGE方法基础上加以改善，其主要变化是在解旋和电泳完成后加入了原位杂交这一步骤，从而能够在检测DNA上确定特殊的基因序列，之后可以通过荧光显微镜镜检测得到目的基因DNA片段是否存在损伤。如果FISH标记的荧光信号只是出现在彗星头部，这就表明目的基因所处的DNA片段无损；如果在彗星尾部发现该基因所标记荧光信号，这就表明目的基因所处DNA存在损伤情况。荧光原位杂交一般是通过寡聚核苷酸或cDNA探针在DNA变性以及复性的过程中通过识别目的基因、匹配目的序列基因从而杂交成功，但是这一技术的关键所在是如何能够与在低熔点琼脂糖中包埋的目的DNA杂交。Santos等人通过使用化学变性法，在加入探针前，先将整个载玻片在变性液中放置30min，然后再将其置于中和液内中和，通过不同梯度乙醇进行脱水处理，最后加入探针杂交。

Reite等人^[21]利用该方法技术检测了病人口咽癌细胞中EGFR基因的表达，从而证实了在口咽癌细胞中，EGFR基因存在表达现象。

随着SCGE方法的不断发展，为了让我们更加细致，明确地分析SCGE实验结果图，分析尾矩、尾部DNA、头部DNA含量等。国内外已经研发了各类分析软件。除了部分昂贵的商业软件外，也出现了一些免费的彗星分析软件。如CASP软件，其能够测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部DNA含量、尾矩等多项参数，而且软件操作简便、快捷，便于使用。

同样，随着SCGE方法的发展及不断使用，各种SCGE试剂盒也应运而生，使该方法的操作更加简单，方便。

5 展望

相比其他实验方法，在DNA损伤检测方面，SCGE是一种敏感、可靠而且快速方法。它可以检测DNA双单链断裂，可精确到单个细胞。鉴于其总体特征及优势，在过去的十几年里，该方法发展迅速，已广泛应用于各个方面。

SCGE在基因毒性、临床、DNA修复、环境生物监测、人工监测和生物信息学等领域的发展前景几乎是无限的。在未来，SCGE还可能会影响其他重要领域，并不断发展。