2017, Vol. 15
2. 广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004;
3. 广西科学院，南宁 530007
2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China;
3. Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530007, China
普鲁兰酶 (Pullulanase，EC 3.2.1.41) 是一类水解α-1, 6-糖苷键脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖而得名，该酶可以水解支链淀粉的α-1, 6-糖苷键而将淀粉分解为葡萄糖、麦芽糖、果糖等食用甜味剂；在以纤维素和淀粉质为原料的生物加工过程中，葡萄糖淀粉酶类水解直链的α-1, 4-糖苷键，普鲁兰酶专门水解支链α-1, 6-糖苷键，使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，形成一系列链长短不一的直链淀粉，可见普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶配合使用，可以显著提高淀粉类原料的利用率，因此，普鲁兰酶在食品、纺织和生物能源等领域有重要的用途[1]。
不同来源的普鲁兰酶由于其活性低和稳定性差等特点，限制了该类酶的工业化应用。研究发现，长野芽孢杆菌普鲁兰酶 (Bacillus naganoensis pullulanase, BnPulB) 的最适反应温度为62.5 ℃，在pH为4.5~5.0范围内保持90%的酶活性，这些酶学特性与淀粉糖化过程较高的温度 (55~65 ℃) 和微酸性环境 (pH 4.5~5.5) 相符合，表明长野芽孢杆菌普鲁兰酶有更大的工业应用潜力[2]。
同源建模法 (Homology model) 是从蛋白质的氨基酸序列出发预测其三维模型的常用方法，为研究未知结构蛋白质的功能提供基础，如果目的蛋白与模板蛋白的序列同一性大于60%，同源建模的结果将接近实验测试的结果[3]。为了进一步提高酶的活性和稳定性等特性，本研究通过对长野芽孢杆菌普鲁兰酶进行同源建模及其结构分析，并预测其活性部位和功能位点，为改良酶的性能提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 序列来源长野芽孢杆菌普鲁兰酶BnPulB的蛋白质序列来源于NCBI，该酶是由926个氨基酸残基组成的多肽，其GenBank登陆号为AEV53626，本研究所采用的6个普鲁兰酶序列及其晶体结构数据 (见表 1) 取自蛋白质数据库 (Protein Data Bank, PDB)[4]，序列分析利用DiAlige服务器 (http://www.genomatix.de/) 进行[5]。
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表 1 BnPulB与6个有晶体结构的普鲁兰酶序列同一性 Table 1 Pairwise sequence identity of BnPulB and 6 known crystal structure pullulanases |
将BnPulB蛋白质序列提交到在线服务器SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) 进行自动模式搜索和同源建模[6]，用PyMol生物软件对其模型进行结构分析和作图。
1.3 底物对接和活性位点分析用Autodock 4.2生物软件对普鲁兰酶BnPulB与底物进行柔性对接及其活性位点分析[7]。
2 结果与分析 2.1 BnPulB的同源建模通过在线服务器SWISS-MODEL自动模式搜索 (各参数为默认值)，发现BnPulB与普鲁兰酶家族的有不同程度的序列同一性 (见表 1，各酶的PDB编号分别为2WAN、3WDI、2E9B、2YA0、2YOC和2FHC，aa表示蛋白序列的氨基酸残基个数)，其中它与嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶 (Bacillus acidopullulyticus pullulanase, BaPul13A) 蛋白质序列同一性达64%，以BaPul13A三维结构 (PDB：2WAN，1.65Å) 为模板[8]，对BnPulB进行同源建模，得到N端和C端分别缺失108和8个氨基酸的并由其Pro109~Gln918区间氨基酸肽段组成的分子量更小的结构，其QMEAN值仅为-0.01，加上BnPulB蛋白质序列与模板BaPul13A的同一性很高，可见BnPulB同源建模的结果接近实验测试的结果。
2.2 BnPulB结构分析将BnPulB模型与BaPul13A的进行整体结构比对分析，发现这两个酶各残基的Ca原子空间坐标几乎完全重叠，其总体RMSD值仅为0.050Å，表明BnPulB结构与BaPul13A的结构非常相似，两者的整体结构几乎重叠在一起 (见图 1)。
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图 1 普鲁兰酶BnPulB与BaPul13A结构重叠分析* Figure 1 Structural superposition of pullulanase BnPulB and BaPul13A *注：图中BnPulB的结构为蓝色，BaPul13A结构 (PDB编号：2WAN) 为粉红色，BaPul13A催化三联体为Asp622、Glu651和Asp736三个氨基酸残基，对应BnPulB的分别为Asp619、Glu648和Asp733.彩图见电子版 (http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2017年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002)。 |
将BnPulB模型与表 1中所述的6种普鲁兰酶同时进行结构比对 (见图 2)，由于它们的序列长度和序列本身存在较大差异 (见表 1)，它们的整体结构并不完全重叠 (见图 2(a))，但它们的活性中心的结构 (底物结合口袋) 却非常相似 (见图 2(b))，其氨基酸残基高度保守，都由空间坐标几乎重叠的Asp、Glu和Asp三个残基构成催化三联体 (见图 2(c))，表明不同来源的普鲁兰酶在漫长的家族进化过程中存在未知的可变性，它们整体的序列同一性可能很低，但其催化区是高度保守的，符合蛋白质生物进化的基本规律，可见长野芽孢杆菌普鲁兰酶的催化区同样具有普鲁兰酶家族共同的结构特点。
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图 2 BnPulB与6种普鲁兰酶的结构比对分析* Figure 2 Structural superposition of BnPulB with 6 known pullulanases 注：图中BnPulB (蓝色)、2WAN (粉红色)、3WDI (红色)、2E9B (青色)、2YA0 (黄色)、2YOC (红色)、2FHC (灰色)。彩图见电子版 (http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2017年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002)。 |
已有研究表明，BaPul13A是由Asp622、Glu651和Asp736三个氨基酸残基构成其催化三联体，在CAZY GH13糖苷酶家族中，这三个位于催化区的氨基酸残基非常保守，在酶的催化过程中，Asp622充当进攻底物的亲核基团，Glu651作为广义的酸碱催化剂，Asp736对酶-底物复合物的过度态起到稳定性的作用[8]。通过结构比对分析，可以预测，构成对应的长野芽孢杆菌BnPulB催化三联体是由Asp619、Glu648和Asp733三个氨基酸残基构成 (如图 1和图 2(c)所示)，这三个残基与表 1所述的6种同类普鲁兰酶催化三联体的空间坐标大致重叠 (见图 2(c))，因此这三个残基在酶的催化过程中可能起到与BaPul13A催化三联体相似的关键作用。
BaPul13A是由921个氨基酸残基组成CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14多结构域的蛋白，其中X45a-X25-X45b的功能未知，CBM48为糖原结合结构域，催化结构域GH13_14属于CAZY GH13家族，其N端1~100氨基酸为功能未明的结构域CBM41，CBM41高度无序而无法模拟其结构[7]。Chen等[9]最新研究表明，删除BaPul13A酶的CBM41结构域，能有效地提高该酶的可溶表达和分泌水平，突变酶的活力是野生酶的2.9倍，并且其作用的温度和pH与野生酶的相当，由此可见CBM41结构域是酶分子上冗余的元件，删除该结构域的突变酶更适合工业化应用。因此，可以推断，长野芽孢杆菌普鲁兰酶BnPulB对应的N端1~108氨基酸可能是酶分子上冗余的序列，删除这个结构可能得到分子量更小的结构更稳定的突变酶。
Wang等[10] 近期研究发现，删除长野芽孢杆菌BnPulB酶N端前106个氨基酸残基，或C端9个，或C端36个残基的突变体，突变酶的催化温度和pH没有改变，突变酶对底物亲和力和催化效率有不同程度的改观，与本研究预测的结果基本相符。
通过结构比对分析，BnPulB各结构域在酶分子上的氨基酸区间分布如图 3(a)所示，各结构域在酶空间结构的分布如图 3(b)所示，其中X45a、X25和X45b结构域远离酶的催化区 (GH13_14结构域)，它们可能有助于结合更大分子的底物，与酶的结构稳定性有关；CBM48是糖原结构域，它和催化区的GH13_14结构域邻近，这两个结构域的结合维持了这个脱支酶的基本功能。BnPulB的催化三联体位于GH13_14结构域，底物位于该结构域的深沟中，GH13_14结构域与酶的催化作用密切相关，改变这个结构域的相关氨基酸可能会明显影响酶的活性和催化稳定性。Chen等[11] 将BaPul13A酶位于GH13_14结构域的3个氨基酸残基同时突变 (E518I-S662R-Q706P)，突变体酶在60 ℃的半衰期是野生型的11倍，最适反应温度也从60 ℃提升到65 ℃。由于与BaPul13A酶的空间结构非常相似，若将BnPulB空间位置对应的氨基酸残基 (E515、A659和L703) 进行相应的突变，也可能得到相应性能更稳定的突变酶。这种通过比对结构类似的 (关键位点的氨基酸残基存在差别)，并经过突变其相应关键位点氨基酸残基来影响酶功能的方法 (类比差别法)，将为酶的分子改良开辟一条新的途径。
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图 3 长野芽孢杆菌普鲁兰酶 (BnPulB) 的三维结构图* Figure 3 3-D structure of the Bacillus naganoensis pullulanase (BnPulB) 注：图 (b) 的BnPulB结构用卡通图形显示，结构域X45为黄色，X25的为青色，CBM48为蓝色，GH13_14的为粉红色，麦芽三糖分子为棍棒模型；图 (c) 活性中心邻近氨基酸残基以绳形显示，麦芽三糖 (棍棒模型) 与氨基酸残基 (粉红色) 形成的氢键以虚线显示。*彩图见电子版 (http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2017年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201606002)。 |
用软件Autodock 4.2将底物与酶分子进行对接，将BnPulB的催化三联体Asp619、Glu648和Asp733设定为柔性残基，经分析得到这三个氨基酸残基的中心坐标，将Gridbox中心设定为X:39.21，Y:37.82，Z:-29.32，将Gridbox大小设定为30×52×32(单位Å)，格点间距为默认值0.375 Å，对接过程选择Lamarckian genetic algorithm (LGA) 遗传算法，其他条件均为默认值。由于普鲁兰糖是由α-1, 4-糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1, 6-糖苷键聚合而成的分子量达2万~200万之间直链状多糖，本研究以构成普鲁兰糖单元的麦芽三糖为配体，麦芽三糖分子从厌氧芽孢杆菌LM18-11(Anoxybacillus sp. LM18-11) 的同类普鲁兰酶晶体结构 (PDB：3WDI) 中提取[12] 。
分子对接结果见图 3(b)，底物分子深埋在酶分子的GH13_14结构域空穴中，底物结合口袋由多个氨基酸残基组成，其结合自由能为-2.75 kcal/mol，抑制剂常数Ki=9.58 mM，底物分子的成功对接，为研究酶与底物的相互作用，研究酶的活性中心及其分子改良奠定了理论基础。
2.4 活性中心分析根据底物对接的结果，表明构成BnPulB的底物结合区和催化区的结构非常复杂，如图 3(c)所示，由Trp504、Try506、Asn552、His553、Ser583、Thr585、Arg617、Asp619、Leu620、Glu648、Trp650、Thr651、Arg681、Val688、Tyr728、Ser731、His732、Asp733、Asn734和Asn788 20个氨基酸残基组成酶的活性中心，其中催化区直接与麦芽三糖形成的氢键的有Ser583、Asp619、Glu648、Trp650、Asp733和Asn734 6个关键氨基酸残基，其催化三联体由Asp619、Glu648和Asp733 3个氨基酸残基组成，这3个残基在同类酶中高度保守 (见图 2(c))，直接突变这些位点，可能使酶失去活性，因此，可以考虑对构成其活性中心的其他非形成氢键的残基着手，进行适当的突变来优化其底物结合口袋和催化区的结构，从而提高酶的催化效率；也可以通过研究与活性中心邻近 (5~15 Å) 的氨基酸残基来优化酶的构象或微环境来改善酶的特性[13] 。
3 结论与讨论本研究对长野芽孢杆菌普鲁兰酶BnPulB进行同源建模，构建了BnPulB蛋白的三维结构。通过理论模拟表明，该普鲁兰酶具有CBM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13_14多结构域的结构，其催化区位于GH13_14结构域，它的催化三联体由Asp619、Glu648和Asp733三个氨基酸残基组成，符合已知同类普鲁兰酶结构的相关特性；酶与底物对接及其活性中心的预测和分析表明，普鲁兰酶家族的底物结合口袋非常相似，BnPulB与底物形成氢键的氨基酸残基为Ser583、Asp619、Glu648、Trp650、Asp733和Asn734，突变这些残基可能使酶失去活性，所以在分子改良时，可考虑对BnPulB活性中心没有形成氢键的残基着手来改良酶的特性。本文的研究方法具有操作简单和直观易懂等特点，理论成果对酶的分子改良有一定的参考意义，其不足之处是在同类酶非保守区或非同源性蛋白的预测可能存在较大偏差，其研究方法和理论成果还有待更多的实验验证。
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