2017, Vol. 15
琼脂存在于石花菜科和龙须菜科红藻细胞壁中，主要由琼脂糖和琼脂胶组。其中琼脂糖是由 (1-3)-O-β-D-半乳糖和 (1-4)-O-3, 6-内醚-α-L-半乳糖交替组成的线形链状分子[1]，是目前世界上应用最广泛的海藻多糖之一。琼胶具有胶凝性和凝胶的稳定性，因而在食品工业中常被用作胶凝剂、增稠剂、乳化剂、增量剂、助悬剂、水分保持剂、稳定剂、赋形剂等。
琼胶酶是一种能够降解琼胶，产生琼胶寡糖的酶总称。根据琼胶酶作用糖苷键的不同可以分为两类：α-琼胶酶和β-琼胶酶[2-3]。目前已报道的琼胶酶大多来源于海洋微生物，其中α-琼胶酶主要来自假单胞菌属、单胞菌属和弧菌属，β-琼胶酶主要来源于弧菌属、交替单胞菌属[4]。在许多软体动物的消化液的微生物中可以分离得到琼胶酶，比如滨螺属 (Littorina striata)、海兔属 (Aplysia dactylomela)、冠海詹属 (Diadema antillarum)、鲍属 (Haliotis coccinea)[5-6]。琼胶酶可用做海藻降解的工具酶，多用于多糖结构的研究[7]，琼胶寡糖的制备以及在分子生物学方面也多有应用[8]。
目前关于琼胶酶的研究主要集中在菌种选育和基因工程菌构建上，传统菌株选育出的菌株所产琼胶酶常存在酶活低、稳定性差等缺点，通过基因克隆表达重组琼胶酶蛋白已经成为趋势。从1987年Buttner等[9]首次实现琼胶酶基因的异源表达开始，已经有一定数量的琼胶酶基因被研究，但是国内对琼胶酶基因的研究还不多。课题组从福建漳江口红树林泥样中分离获得一株产琼胶酶菌株，并进行了形态学和16SrRNA鉴定，确定菌种为微球茎菌属 (Microbulbifer sp.)，并通过TAIL-PCR方法克隆得到基因全长。目前报道的微球茎菌属重组琼胶酶还较少，且与此基因编码的蛋白质序列有高同源性的蛋白3wz1A的结构已经得到解析[10]，为rAgaN3的后续研究提供了便利。本文利用生物信息学软件和数据库，预测其理化性质及结构信息，为琼胶酶基因的异源表达和琼胶酶结构与功能关系研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料菌株：Microbulbifer sp. BN从福建漳江口红树林泥样中分离获得，利用TAIL-PCR方法从中克隆得到琼胶酶基因agaN3序列全长。
1.2 分析方法(1) 利用NCBI的blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 和MEGA5.2构建系统进化树；
(2) 利用ProtParam[11](http://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白质的理化性质，包括相对分子质量、氨基酸组成、等电点、不稳定系数、总平均亲水性等；
(3) 利用ProtScale[11](http://web.expasy.org/protscale/) 分析蛋白质疏水性；
(4) 利用TMHMM[12](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 分析蛋白质跨膜区域；
(5) 利用PSIPRED[12](http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 分子蛋白质二级结构，比如分螺旋、卷曲、无规则卷曲等；
(6) 利用PredictProtein[13](https://www.predictprotein.org/) 分析跨膜螺旋区域、二硫桥以及结合位点等性质；
(7) 利用Signal P[14](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析信号肽；
(8) 利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/) 进行保守结构域搜索；
(9) 利用SMART[15](http://smart.embl-heidelberg.de/) 预测结构域；
(10) 利用CAZY[16]数据库 (http://www.cazy.org/GH16.html/) 查询糖苷水解酶信息；
(11) 利用TargetP 1.1[13](http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 分析亚细胞定位及导肽；
(12) 利用SWISS-MODEL[17](http://www.swissmodel.expasy.org/) 进行同源建模；
(13) 利用SAVES[18]服务器 (http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/) 对蛋白结构残基角度检验；
(14) 利用PROSA[19]程序 (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php) 对蛋白结构能量进行检验。
2 结果分析 2.1 基因序列分析rAgaN3的DNA序列共有834 bp，其中第831~834位为终止密码子TAA，该蛋白含有277个氨基酸。基因及蛋白序列如图 1。
从NCBI的BLASTp的序列比对结果中选择12条Identity比较高的序列，与rAgaN3的序列在Clustal X上进行序列比对，然后利用MEGA5.2构建系统进化树。系统进化树构建结果如图 2所示。
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图 1 rAgaN3基因序列和氨基酸序列 Figure 1 rAgaN3 gene sequence and amino acid sequence |
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图 2 系统进化树 Figure 2 Phylogenetic tree |
NCBI数据库中BLASTp同源性分析表明，rAgaN3序列与已知琼胶酶序列agarase Microbulbifer thermotolerans(BAD29947.1)、agarase Microbulbifer thermotolerans(3WZ1A) 以及agarase Microbulbifer sp. AG1(ALN70307.2) 都有88%的序列相似性。
系统进化树节点上的数字是自展值，用来分析进化树分支可信度。0.05代表每100个氨基酸中5个氨基酸替换。由经过给定的repetitions (500次) 重排构树打分后，每个分支对应一个数值。数值越高，表示分支的可信度越高，由此来确定进化远近程度。rAgaN3与Microbulbifer thermotolerans(3WZ1A)、Microbulbifer thermotolerans(BAD29947.1) 的自展值均为100。结合BLASTp同源性分析，基本可以确定该蛋白来自Microbulbifer thermotolerans。
2.2 蛋白质一级结构预测 2.2.1 蛋白质理化性质分析通过ProtParam预测蛋白rAgaN3的理化性质，结果见表 1。
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表 1 rAgaN3理化性质分析表 Table 1 Physical and chemical property analysis of rAgaN3 |
蛋白质内部亲疏水性氨基酸的组成影响蛋白质折叠的程度，蛋白质的折叠情况可利用亲水性分布图来反映。用ProtScale计算出蛋白质亲疏水性分布图，用Hphob. / Kyte & Doolittle标度，各个氨基酸打分分值见表 2。
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表 2 氨基酸分值表 Table 2 Amino acid score |
分析亲水区和疏水区，如图 3所示。
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图 3 琼胶酶氨基酸序列疏水性\亲水性预测 Figure 3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino acid sequence of agarase |
横坐标表示氨基酸位置，纵坐标表示标度得分，Score小于0表示亲水，大于0表示疏水。图中显示亲水性值峰明显多于疏水性值峰，这些亲水性值峰区域常富集富集亲水性氨基酸，同时也是蛋白质进化中氨基酸插入的主要位点[20]，推测此蛋白为亲水性蛋白，蛋白可溶于水。
2.2.3 跨膜区预结构预测与信号肽分析蛋白质的跨膜区域是指蛋白在膜内与细胞膜膜脂相结合的部分，TMHMM是一种基于隐马尔可夫模型的跨膜螺旋预测算法，TMHMM的预测结果如图 4所示。
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图 4 琼胶酶跨膜区预测 Figure 4 Predicted transmembrane domain of agarase |
TMHMM预测rAgaN3跨膜螺旋区域为零，说明该蛋白不是跨膜蛋白，推测该蛋白在细胞内合成之后不能立即分泌到胞外行使功能。
信号肽是将细胞内新合成的蛋白质引导分泌至胞外的短肽链，一般长度为5~30个氨基酸。SignalP是基于神经网络网络算法，预测给定氨基酸序列中潜在的信号肽剪切位点[14]。SignalP 4.1预测信号肽位置，结果如图 5。
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图 5 信号肽预测 Figure 5 Signal P prediction of agarase |
图中C-score是信号肽酶切位点值，一般剪切位点处的C-score最高；S-score是信号肽值，一般信号肽区域的S-score最高；Y-score是综合得出的剪切位点分值。预测结果显示mean S score为0.052，远小于分泌型蛋白标准0.5，结合图 13，可以认为此蛋白没有信号肽。综合跨膜区域和信号肽预测，蛋白rAgN3为胞内蛋白，需要在菌体裂解之后才能在胞外行使其功能。
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图 13 琼胶酶三级结构 Figure 13 Tertiary structure of agarase |
蛋白质二级结构包括螺旋 (Helix)、折叠 (Strand)、无规则卷曲 (Coils) 以及模体 (motif) 等组件。
2.3.1 PSIPRED预测蛋白二级结构PSIPRED通过PSI-BLAST搜索同源序列预测蛋白质二级结构，由于采用严格的交叉验证，使预测平均准确率高达80%。PSIPRED预测蛋白rAgaN3的二级结构结果如图 6所示。
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图 6 琼胶酶二级结构预测 Figure 6 Predicted secondary structure of agarase |
AA代表了目标蛋白质的氨基酸序列。Pred代表了二级结构以及相应的图例 (H:Helix；C:Coil；E:Strand)。Conf数值在1~9变化，数值越高，置信度越高。由PSIPRED预测结果可知：rAgaN3二级结构主要由折叠和卷曲结构构成，其中含有15个折叠结构，其余为卷曲结构。
2.3.2 模体搜索模体 (motif) 表示蛋白质中具有特定空间构象和特定功能的结构成分。用BLAST在默认的情况下进行了CD搜索，向BLASTp提交序列后，获得的结果如图 7所示。
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图 7 模体结构 Figure 7 Motif structure |
该琼胶酶属于糖苷水解类16家族 (GH16)，属于LamG超家族；有11个活性位点分布于75~262氨基酸之间；有3个催化残基，3个Ca2+结合位点，但都在活性区域以外，推断Ca2+对琼胶酶活性可能无太大的促进作用。
2.4 结构域与功能分析 2.4.1 结构域分析结构域是蛋白质序列功能、结构和进化的单元，通常由50~300个氨基酸组成，有空间构象特异性。SMART预测结果如图 8：该蛋白序列56~267位氨基酸对应于Glyco_hydro_16的结构域。
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图 8 琼胶酶结构域 Figure 8 Structural domain of agarase |
Glyco_hydro_16在PFAM数据库的编号为PF00722，进行查看和分析。糖苷水解酶16家族是糖苷水解酶的一个家族。糖苷水解酶 (EC 3.2.1) 是一类广泛存在的酶系，水解两个或以上的糖类。
查询CAZY数据库可知，糖苷水解酶16家族由许多具有已知活性的酶组成，包括:葡聚糖酶、琼胶酶、透明质酸酶、半乳糖苷酶、卡拉胶酶、木聚糖酶等。
2.4.2 PredictProtein预测蛋白信息欧洲分子生物学实验室提供的蛋白质序列和结构预测服务网站PredictProtein，可以得到蛋白质多序列比对、低复杂区、溶剂可及性、跨膜螺旋、卷曲螺旋区、核定位信号及二级结构等信息。其中跨膜螺旋、二硫键、结合位点预测结果分别见图 9、图 10、图 11。
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图 9 跨膜螺旋区域预测 Figure 9 Predicted transmembrane domain |
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图 10 二硫键预测 Figure 10 Predicted disulfide bonds |
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图 11 结合位点预测 Figure 11 Predicted binding sites |
PredictProtein预测得到：rAgaN3无跨膜螺旋区域，与TMHMM预测结果一致。
PredictProtein预测得到：rAgaN3无二硫键结构。
PredictProtein预测得到：rAgaN3存在14个蛋白质结合位点以及2个多核苷酸结合位点。
PredictProtein预测分子功能本体论如表 3所示。
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表 3 分子功能本体论 Table 3 Molecular function ontology |
分子功能本体论表明：该蛋白可能具有水解酶活性，水解O-糖苷化合物 (GO：0004533)；水解酶活性，作用于糖苷键 (GO：0016798)；β-琼胶酶活性 (GO：0033916)；催化活性 (GO：0003824)。可靠性分别为43%、42%、37%, 28%和23%。可以推测该蛋白是一种糖苷水解酶，与结构域分析该酶属于糖苷水解酶GH16结果一致。
PredictProtein生化过程本体论如表 4所示。
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表 4 生化过程本体论 Table 4 Biological process ontology |
生化过程本体论表明：该蛋白参与新陈代谢过程 (GO：0008152)，最初的新陈代谢过程 (GO：0044238)，糖类代谢过程 (GO：0005975) 和有机物质的代谢过程 (GO：0071704)。可靠性分别为35%、27%、27%和27%，可以推测该蛋白参与体内新陈代谢。
2.4.3 亚细胞定位及导肽预测分析用Target1.1进行亚细胞定位及导肽分析，结果如表 5。
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表 5 琼胶酶亚细胞定位 Table 5 Subcellular location of agarase |
Target1.1预测结果显示：该蛋白质氨基酸序列长277个氨基酸，存在线粒体目标肽 (mTP) 的可能性为7.0%，存在信号肽 (SP) 的可能性为7.3%，其他导肽或无导肽的可能性为93.4%。目的蛋白rAgaN3的分泌途径为—型，即定位在其他细胞器，没有剪切位点的序列，可靠性级别为1级。与跨膜螺旋区域、信号肽预测结果相匹配。
2.5 蛋白质三级结构预测 2.5.1 同源建模SWISS-MODEL是目前应用最广泛的在线同建模网站，利用同源建模的方法实现对未知结构的序列的预测。在PDB数据库中找到与琼胶酶rAgaN3的近同源蛋白3wz1A (Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94 GH16家族，β-琼胶酶) 作为模板。rAgaN3与3wz1A的蛋白序列比对如图 12所示。
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图 12 rAgaN3与3wz1A蛋白的序列比对 Figure 12 Sequence alignment of rAgaN3 and 3wz1A protein |
由图 12可以看出，rAgaN3与模板蛋白序列大部分氨基酸是极保守的，相似程度达到88%，用3wz1A作为同源建模模板准确性较高。用SWISS-MODEL预测得到三维结构，序列从N端到C端分别用绿色到红色表示 (见图 13)。可以看出，琼胶酶rAgaN3的主要由β-折叠构成，整体结构类似“三明治”状，由15个折叠结构组成，与Allouch等[21]报道过的GH16家族的琼胶酶β-jelly-roll结构较为类似。
2.5.2 结构合理性评价用SAVES服务器对结构进行PROCHECK评价，PROCHECK程序不考虑能量，只检测结构中的残基之间角度是否合理，生成Ramachandran plot。检测结果见图 14。
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图 14 拉式图 Figure 14 Ramachandran plot |
PROCHECK显示氨基酸残基核心区：91.3%，允许区：8.3%，大致允许区：0.4%，禁阻区：0%，位于可接受区的达到了100%，一般位于可接受区的氨基酸残基大于90%可以认为蛋白结构合理。rAgaN3建模得到的结构符合立体化学的原则，模型各残基之间的角度很合理。
PROSA程序是检测蛋白结构能量常用的工具，反映的是结构中残基之间的能量是否合理。得到的结果一般为负值。程序评价结果见图 15。
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图 15 Z-score图 Figure 15 Z-score of rAgaN3 |
本实验的Z-score为-7.04(图中黑点所示)，蓝色部分为所有已解析的晶体结构的Z-score分布情况。由图可知，rAgaN3的Z-score位于中心的位置，说明该结构在能量上是十分合理的。综合Ramachandran plot和Z-score的结果分析，SWISS-MODEL构建出的琼胶酶结构是相当可靠的。
3 结论重组琼胶酶rAgaN3理论分子量为31.243 kDa，理论等电点为4.81，脂肪系数为62.35，不稳定系数为26.23，小于40，说明蛋白较稳定，总平均疏水性为-0.662，小于0，预测为亲水性蛋白；二级结构预测得到：该蛋白无螺旋结构，有15个折叠结构，其余均为卷曲结构。无信号肽，无跨膜区域也没有二硫桥。根据序列分析表明，rAgaN3属于糖苷水解酶GH16家族，为β-琼胶酶。采用序列比对算法搜索蛋白质结构PDB数据库，找到与琼胶酶rAgaN3的近同源蛋白3wz1A (Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94 GH16家族，β-琼胶酶)，序列相似性达到88%。运用同源建模法，使用SWISS-MODEL构建重组琼胶酶rAgaN3的三维结构模型，可以认为此琼胶酶是典型的GH16家族琼胶酶结构，并用PROCHECK和PROSA进行了结构检验。
本研究从琼胶酶的序列出发，对序列中包含的生物信息进行了系统的研究，预测了琼胶酶rAgaN3的基本理化性质，为理解琼胶酶特性提供了参考。后续工作可以本文预测信息为基础，将基因在大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行异源表达，并对重组琼胶酶的酶学性质进行测定，以验证生物信息学预测结果。用高同源性的模板同源建模得到的较可靠的蛋白质三维结构，为理解琼胶酶的结构特性以及催化机制打下了良好的基础。并且可以从蛋白质的三维结构出发，通过分子对接、分子动力学模拟等方法，以提高比活力以及改善酶学性质为目标，预测潜在的突变位点并进行定点突变实验，深入研究琼胶酶结构与功能的关系。
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