2016, Vol. 14
2. 辽宁大学环境学院, 沈阳 110036;
3. 辽宁大学轻型产业学院, 沈阳 110036
2. School of Environmental Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China;
3. College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China
大肠杆菌DnaK蛋白是热休克蛋白70(Hsp70,Heat shock protein 70)家族的重要成员，以分子伴侣形式发挥作用，帮助新蛋白质的正确折叠，错误折叠和聚集蛋白的重新折叠，调节蛋白的活性控制，细胞器和分泌蛋白的跨膜易位等[1-2]，而因为DnaK在蛋白质内稳态网络中具有的中心作用，对DnaK的结构和功能的研究是很有意义和价值的[3]。
DnaK蛋白与其他Hsp70s相同，都由一个N-端高度保守的核苷酸结合功能域和一个C-端的底物结合功能域(SBD,substrate-binding domain)组成，两者之间可以通过变构作用进行相互调节，相互影响[4]。其中，NBD的结构类似于凝集素和己糖激酶，由4个子域组成，分别是Ⅰ-A(残基3-38；112-184),Ⅱ-A(残基185-228；310-388),Ⅰ-B(残基39-111),Ⅱ-B(残基229-309)。这些子域通过两个交叉的α-螺旋相连接，在子域的中心形成一个包围核苷酸与金属粒子的特定结合口袋，对ATP进行水解，而在NBD对ATP水解时，能够刺激增强C-端另一功能域SBD部位的底物亲和能力，从而降低SBD的底物交换率，影响Hsp70发挥伴侣活性与帮助蛋白重折叠等功能，所以研究核苷酸结合功能域对ATP的水解能力，即ATPase活性，对研究Hsp70的各种功能有重要意义[5-6]。
之前，Peter等人的研究指出，DnaK蛋白中位于NBD的Ⅱ-A和Ⅱ-B之间的一些在域间通信中起扭链作用的残基，在变构调节中发挥重要作用[7]，他们选出一些重要的扭链残基(见图 1)，对其进行突变后，发现其ATPase活性发生了变化。其中，突变体S203A、G228A的ATPase活性增强，突变体I202A、L227A的ATPase活性减弱，突变体G223A和WT的ATPase活性基本一致。但是，Peter等人并没有从分子水平去探讨扭链残基突变体ATPase活性变化的原因，对DnaK蛋白中扭链残基突变与ATPase活性变化之间的关系研究仍不太清楚，尚需进一步研究。另外，McKay等人研究发现牛Hsc70(Heat shock cognate 70 protein)的T13位点(同源于DnaK蛋白T11)的自身磷酸化与ATPase活性有重要关系[8]，并且T13侧链的烃基对ATPase活性有重要作用[9]。此外，Chiappori 等人研究Hsp70与Hsp40相互作用时发现，DnaK蛋白中β220(214-221)部位的紧致性对ATPase活性也有重要影响，这部位结构越紧致，越容易与DnaJ蛋白的J结构域相结合，从而促进ATP的水解[15]，并且β220与这些突变的扭链残基位于同一部位上，这些扭链残基突变后，可能使相连的β220部位的紧致性产生了改变，从而使其与DnaJ蛋白J结构域相互作用情况发生改变，影响DnaJ对ATP的水解刺激作用，影响ATPase活性，而我们的模拟结果也证实了这一点。
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图 1 WT模型平衡后构象展示及各扭链残基与重要部分 Figure 1 The show of WT models and the hinge residues and important parts after equilibrium |
本研究不仅是对Peter等人生化试验数据进行分子动力学上的解释，也是对Chiappori 等人研究结果的进一步验证，对后续其他Hsp70蛋白家族中氮端NBD，特别是扭链残基的研究具有重要的借鉴与指导意义。
1 实验过程 1.1 蛋白质来源及同源建模本研究采用RCSB蛋白数据库中大肠杆菌DnaK蛋白经典核苷酸结合域模型(PDB编号1DKG: D)[10]，并参考与DnaK蛋白同族的包含有小分子ATP的Hsp70与ATP结合状态模型(PDB code：4B9Q: A)为模板[11]，通过同源建模软件Modeller9v8构建DnaK蛋白NBD-ATP 结合状态的WT与突变体I202A、S203A、G223A、L227A、G228A三维结构模型。所有结构模型均使用Procheck对其合理性进行了评估。
1.2 动力学模拟过程分子动力学模拟均在GROMACS 4.5.5 [11] 软件包下完成,模拟体系DnaK蛋白核苷酸结合域直接使用GROMOS96 43a1力场[12]，小分子ATP使用PRODRG2服务器(http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg)添加基于GROMACS的小分子ATP的力场[13]。然后将蛋白配体模型溶于约包含26 186个SPC216水分子的立方体盒子中，蛋白边缘与盒子边缘的最小距离为1.0 nm。采用LINCS(linear constraint solver)算法对体系中所有键长进行约束。范德华力通过LJ势(Lennard-Jones potential)方法进行估算，截断半径为1.0 nm。静电相互作用采用PME(Particle mesh Ewald)算法进行估算，截断半径为1.0 nm。体系采用NPT系综，温度和压力通过采用V-rescale 和Parrinello-Rahman 算法分别维持在300 K和1 bar，pH为7.0。体系中加入Na+或Cl-中和多余电荷，中和后的中性体系先进行2 000步的能量最小化，然后进行80 ps的限制性模拟。最后各体系在恒定的温度和压力下进行10 ns分子动力学模拟。分子的运动轨迹每4 ps保持一次，用于后续的数据分析。
1.3 蛋白对接本模拟利用PatchDock网站服务器进行蛋白-蛋白对接实验[14]，DnaJ模型使用(PDB编号1XBL: A)，相应结合位点根据Chiappori等人文献中确定[15]，其他设置默认，然后与平衡后各模型分别进行对接，根据打分函数对结果进行相应排序，用网站上后续工具FireDock评测其中最优的10个构象结合所需的结合能[17]。
2 结果与讨论 2.1 结构稳定性RMSD ( Root mean square deviation，均方根偏差) 是评价蛋白质稳定性的一个重要参数，通过比较RMSD曲线我们发现各模型在7ns后均达到结构保持稳定的平衡状态(见图 2)。
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图 2 NBD主链的RMSD* Figure 2 The RMSD values of the backbone of NBD 注：*彩图见电子版(http://swxxx.alljournal.cn/ch/index.aspx)(2016年第3期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.03.03 )。 |
其中除S203A外，所有突变体的RMSD波动都比较大，但活性增强突变体S203A其实在5-7ns时波动也较野生型大，平衡后构象也与野生型也有很大差别(见图 3)。这说明所有突变体与野生型相比，其构象都发生了一定变化。平衡过程中，各模型的整体RMSD值，分别如下：WT(0.24 nm)，I202A(0.27 nm)，S203A(0.26 nm)，G223A(0.30 nm)，L227A(0.32 nm)，G228A(0.35 nm)，并且RMSD值明显随扭链残基所在部位不同，呈现分级趋势，202位点与203位点，虽然ATPase活性变化相反，但两位点却相邻在一起，而223、227、228这三个位点RMSD值比其他都大，它们也都在另一相连部位(见图 3)。从这可以看出，突变不同部位的扭链残基，其引起的波动程度也是有差别的。而为什么活性基本不变的突变体G223A的RMSD波动也非常大，可能是其引起波动的部位与ATPase活性无关或者影响作用被抵消的原因，这需要进一步研究。
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图 3 野生型WT与活性增强突变体S203A平衡后三维构象对比 Figure 3 The comparison of three-dimensional conformation between WT and the positive mutant S203A after equilibrium |
ATP与NBD间的相互作用是影响DnaK蛋白ATPase活性变化的直接原因之一，主要有氢键、盐桥、疏水作用，结果如下(见表 1)，其中G223A突变体活性虽然与野生型差不多，但与ATP相互作用是增强的，尤其是G223A的氢键作用是远远强于其他突变体的，NBD与ATP间相互作用结果并没有什么明显的规律。
不过进一步查看NBD与ATP间氢键作用存活时间发现(见图 4)，影响ATPase活性的重要残基T11与ATP之间的氢键作用具有明显规律。活性不变突变体G223A虽然整体与ATP氢键较多，但其T11:ATP只有一条(100%)，与野生型的类似T11:ATP(98%)，活性减弱突变体I202A没有T11:ATP的氢键，而L227A只有一条T11:ATP(92%)，但存活时间比野生型弱，这可能与其活性减弱有一定关系。并且活性增强突变体S203A、G228A都具有两条强T11:ATP的氢键，S203A的两条还强于G223A突变体的，ATPase活性规律符合，这很可能是影响扭链残基突变体活性变化的重要原因。
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表 1 模拟过程中各模型NBD与ATP间相互作用结果 Table 1 The results of interaction between NBD and ATP in all the models during MDs |
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图 4 模拟过程中NBD与ATP间氢键存活时间 Figure 4 The Hydrogen bond existence map of NBD and ATP during MDs |
进一步根据McKay等人的研究，提取T11与ATP残基的距离发现(见图 5a)，活性减弱突变体I202A、L227A的T11在整个模拟过程中，与野生型和活性增强、活性不变突变体相比，T11明显的远离了ATP，使其更难与ATP相互作用，这可能是其与ATP间氢键作用减弱的主要原因。
而继续提取T11的烃基与ATP的γ-磷酸基团间的距离(见图 5b)发现，扭链残基突变体T11距离的变化与ATPase活性间的关系更加明显，其平衡过程中的T11:ATP平均距离如下：WT(0.43 nm)，活性增强突变体S203A(0.40 nm)、G228A(0.39 nm)，活性减弱突变体I202A(0.59 nm)、L227A(0.45 nm)，活性基本不变突变体G223A(0.42 nm)。活性增强突变体的T11烃基与ATP的γ-磷酸距离变近，更易接触，形成更多的氢键作用；活性减弱突变体间的T11烃基与ATP的γ-磷酸距离变远，更难接触，形成较少或没有氢键作用，虽然L227A的距离增大并不太明显，氢键结果也显示了这一点，只是稍微减弱，可能还有其他影响L227A的ATPase活性变化的原因；另外，活性基本不变突变体T11烃基与ATP的γ-磷酸距离稍微减小，基本不变，氢键作用强弱也不改变，对ATP的水解活性也基本不变，在一定程度上能说明Peter等人的生化实验结果。
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图 5 重要位点T11与ATP距离* Figure 5 The distance of important loci T11 and ATP 注：*彩图见电子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2016年第3期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.03.03 )。 |
进一步查阅文献，Chiappori等人的研究结果表明，DnaK的β220(214-221)部分紧致性能影响与DnaJ结合，从而影响ATPase活性[15]，而扭链残基都与β220部分相连，推测是不是这些扭链残基突变后，从而影响了相连的与DnaJ结合β220部分发生改变，从而造成ATPase活性发生变化。
而蛋白质结构的紧致性可以通过其Rg(Radius of gyration，回旋半径)来分析[16]，Rg越大，表明其紧致性越低，通过提取各模型在模拟过程中β220的Rg发现(见图 6)，活性减弱突变体I202A、L227A的Rg增大很多，I202A(0.51 nm)、L227A(0.51 nm)，其β220部位紧致性降低，其中，I202A的Rg在整个模拟过程中都比WT高很多，L227A的Rg在平衡过程中急剧升高，最后体系平衡后，活性减弱突变体的Rg都保持在一个很相似的程度，这也表明，平衡之后的Rg值可能更准确。另外如图 5所示，平衡过程中，活性基本不变突变体G223A与WT的Rg基本保持一致G223A(0.48 nm)、WT(0.48 nm)，而活性增强突变体S203A、G228A的Rg减小，S203A(0.47 nm)、G228A(0.47 nm)，紧致性增强，可见，与突变点相连的β220部位的紧致性在ATPase活性变化中具有一定的规律，与最后ATPase活性变化结果符合，故扭链残基突变后，可能也通过引起相连的β220部位紧致性发生改变，从而影响与DnaJ的结合，影响了ATPase的活性，对T11烃基与ATP的γ-磷酸距离变化规律形成补充，共同影响造成最后ATPase活性变化结果。
2.4 蛋白-蛋白对接与结合能分析通过PatchDock网站进行DnaK与DnaJ对接，结果见图 7，以对接后得分最高构象为例，DnaK与DnaJ对接后，野生型与活性基本不变突变体DnaK和DnaJ间的平均距离差别不大，WT(10.6 nm)、G223A(10.7 nm)，活性减弱突变体与DnaJ的平均距离增大，I202A(11.4 nm)、L227A(11.7 nm)，活性增强突变体与DnaJ的平均距离减小，S203A(9.2 nm)、G228A(9.5 nm)，这一结果能在一定程度上反应DnaK与DnaJ蛋白作用情况，但两蛋白之间相互作用距离只是反映其相互作用强弱的一个方面，进一步对大范围各模型与DnaJ对接结果进行分析，主要是能直接反应相互作用情况的平均所需结合能的分析(见表 2)。
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图 6 模拟过程中β220 Rg随时间的变化* Figure 6 ime dependence of the Rg in region β220 during MDs 注：*彩图见电子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2016年第3期doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.03.03 )。 |
发现其中所有突变体都比野生型形成更多构象，DnaK与DnaJ接触面积增加，虽然活性减弱突变体反而倾向形成最多的构象，I202A(638个)、L227A(622个)，远远多于其他突变体。不过进一步的结合所需能量结果发现，活性减弱突变体虽然倾向形成更多构象，但其结合所需能量远远高于其他突变体，更难与DnaJ结合，影响DnaJ刺激ATP水解。而活性不变突变体G223A所需结合能显示与野生型相差不多，活性增强突变体S203A、G228A所需结合能量比野生型减少，更有利于结合。
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图 7 各DnaK模型与DnaJ蛋白对接后得分最高构象及平均距离展示 Figure 7 The highest score conformation after DnaK model docking with the DnaJ and the average distance |
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表 2 蛋白对接结果统计 Table 2 The statistical results of protein docking |
这说明突变体的紧致性变化的确影响会其与DnaJ的结合情况，从而影响ATPase活性变化。至于为什么活性减弱突变体倾向形成最多的突变体，这可能与其β220下面部分形成更多的β片层有关。另外，也不排除β220及其相连部位也是NBD向SBD域间信号传递的重要扭链区域之一，将核苷酸信号改变通过一系列扭链区域作用传递到域间linker和SBD中[7]，那么反过来，β220及其相连部位扭链的结构改变，如紧致性、β片层程度变化，也可能会对ATPase活性产生直接影响，但具体是怎样影响和传递的，本实验还没有找到明确规律，尚需要进一步的研究。
3 结 论通过分子动力学模拟的实验数据可知，活性增强突变体S203A、G228A突变引起ATPase活性区域重要残基T11的烃基与ATP的γ-磷酸基团靠近，使ATP更容易与T11发生反应，提高ATP水解速率，从而增强ATPase活性；活性基本不变突变体G223A突变没有使T11烃基与ATP的γ-磷酸基团距离发生改变，从而使ATP水解速率与野生型时一样，不改变ATPase活性；活性减弱突变体I202A突变使T11的烃基与ATP的γ-磷酸基团远离，使ATP更难与T11发生作用，从而降低ATP水解速率，降低ATPase活性，L227A虽然远离的不明显，但其与突变残基相连的β220(214-221)部位的紧致性降低，所需结合能增大，难与DnaJ结合，从而影响了其ATPase活性。另外，活性增强突变体S203A、L227A突变使相连的β220的紧致性增强，更易结合，所需结合能减小。活性基本不变突变体G223A紧致性与所需结合能结果也与ATPase活性结果相符，所以，扭链残基突变体很可能是通过突变引起T11部分与β220部分结构改变，从而影响了其ATPase活性的。
本研究为我们从分子水平上解释Peter等人的生化实验结果提供了数据支持，同时也从分子水平对McKay等人研究发现的牛Hsc70的T13位点(同源于DnaK蛋白T11)侧链的烃基对ATPase活性有重要影响在DnaK中进行了验证，另外，也对Chiappori 等人研究发现的DnaK蛋白中β220(214-221)部位的紧致性对ATPase活性也有重要影响的结果进行了进一步的验证，对后续的Hsp70家族NBD部分突变及机制的研究有重要的借鉴作用。
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