阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)，又称老年性痴呆，是一种复杂的中枢神经系统退行性疾病, 以高级认知功能障碍为特征，以老年斑、神经纤维缠结和神经元丢失为主要病理改变的综合病。阿尔茨海默病发病率与年龄呈现正相关性。据估计，65岁老年人发病率为4.4%，90岁以上老年人的发病率是22%^[1]。随着世界人口日趋老龄化，阿尔茨海默病已经成为当前老年医学面临的最严峻的问题之一。在我国，人口的老年化进程不断加快，如何对这两种常见老年疾病进行有效地预防和早期治疗，已成为我国面临的一项关系到国家人口研究数据识别阿尔茨海默相关的风险位点和遗传通路。

目前，欧洲和美国研究人员普遍采用全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies, GWAS)和候选基因研究的方法筛选阿尔茨海默病易感基因, 取得了前所未有的成就。一些新的阿尔茨海默病易感基因，例如CR1, BIN1, CLU, PICALM, MS4A4/MS4A6E, CD2AP, CD33, EPHA1和ABCA7等已经被逐渐报道^[2]。AD作为一种人类复杂性状，涉及多个基因，但是每个基因对表型只有较小或微小的影响，只有若干个基因共同作用，才可对表型产生明显影响，即个体表型是与多个基因相关的变异协同作用的结果。因此，利用生物信息学识别AD相关的遗传学通路，更能揭示潜在的遗传机制。本研究通过利用生物遗传通路分析方法，分析基因组关联研究AD数据，识别影响AD的生物学遗传通路，揭示AD潜在的遗传机制。

1 材料与方法 1.1 遗传关联研究数据

选取一套AD GWAS数据，该数据公开获得。该数据包含11 789欧洲人，其中有3 941 AD病例个体和7 848个对照个体。本套数据包含529 205个人类常染色体单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)数据。所有SNP信息来自人类基因组版本37(Human genome build 37)和SNP版本132(dbSNP build 132)。加性模型下的回归分析用来衡量单个SNP和AD的关联。最终，我们得到了761个P<=1.00×10^-3的SNPs。更多详细信息在文章中有描述^[3]。

1.2 方法 1.2.1 基因水平上检验AD GWAS

利用ProxyGeneLD软件进行基因水平上的检验。该软件考虑到人类基因上复杂的连锁不平衡模式，利用HapMap数据的连锁不平衡信息^[4]，矫正由于基因长度所引起的显著性膨胀问题。如果有一些SNP在HapMap数据中高度连锁平衡(r2>0.8)，那么这些SNP归为一类，作为单个遗传信号。然后检验每个GWAS显著的SNP是否包含在某一个类里面。最后，每个基因都赋予一个经过多重检验矫正的P值。我们选取矫正后P < 0.05的基因进行通路水平上的检验。

1.2.2 通路水平检验AD GWAS

利用WebGestalt数据库进行遗传通路分析，连接地址为： http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/^[5]。对于一个给定的通路，采用超几何分布检验识别这一通路与AD关联是否显著。在某一个通路中观测到K个AD相关基因的P值可以计算为：

$P = 1 - \sum\limits_{i = 0}^k {\frac{{\left( \begin{array}{l} S\\ i \end{array} \right)\left( \begin{array}{l} N - S\\ m - i \end{array} \right)}}{{\left( \begin{array}{l} N\\ m \end{array} \right)}}} $

N是所有参考基因的数据, S是所有AD相关基因的数目，m是通路中含有的基因的数目，K是通路中含有的AD相关基因的数目。我们采用FDR(False discovery rate)方法进行多重检验校正^[5]。对于任何一个通路，如果校正后的P < 0.05，并且含有至少5个AD相关基因，则认为这个通路和疾病显著相关。

2 结果与分析 2.1 显著富集的KEGG通路

利用ProxyGeneLD软件进行基因水平上的检验，识别出320个AD基因。根据WebGestalt进行通路水平上的检验，分别发现了8个显著的KEGG通路(P < 0.05)。其中Cell adhesion molecules，是最显著的遗传通路。其它通路主要包含3个心血管疾病通路(Dilated cardiomyopathy, Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy和Hypertrophic cardiom-yopathy), 代谢通路(Glycosaminoglycan biosynthesis-chondroitin sulfate和Purine metabolism)，神经系统和疾病(5个), 见表 1。

2.2 显著富集的GO通路

利用320个AD基因，我们得到了41个显著的功能类P < 0.05。我们进一步发现这些功能里都与代谢有关。主要包含reverse cholesterol transport (GO:0043691), phospholipid efflux (GO:0033700), triglyceride homeostasis (GO:0070328), activation of phospholipase C activity (GO:0007202), lipid metabolic process (GO:0006629), cholesterol efflux (GO:0033344), cholesterol homeostasis (GO:0042632), cholesterol metabolic process (GO:0008203), lipid transport (GO:0006869)，和lipoprotein metabolic process (GO:0042157)。有趣的是, cell adhesion (GO: 0007155)依然是第三显著的通路P=1.90×10^-5。本研究中我们列出前10个显著的功能类, 见表 2。

3 讨论与结论

生物信息学是生命科学、计算机科学和信息科学等学科逐步发展相互渗透的新兴交叉学科。随着对人类基因组计划的深入研究，生物信息学得到了蓬勃的发展，尤其是在了解各类疾病的发生机制及遗传基础上发挥了重要作用^[6]。通过识别出与疾病发生发展相关的基因和通路，再据此进行实验验证，将是一种高效的研究途径。AD是一种复杂疾病，利用生物信息学识别AD相关的遗传学通路，更能揭示AD潜在的遗传机制。本研究我们利用生物信息学方法，采用生物遗传通路分析了一套AD全基因组关联研究数据。

本研究中，我们利用ProxyGeneLD软件进行基因水平上的检验，检测出320个显著(P < 0.05)的AD基因。利用WebGestalt进行通路水平上的检验，发现了8个显著的KEGG通路和41个显著的GO功能类(P < 0.05)。其中，我们发现Cell adhesion molecules是KEGG中最显著的遗传通路，也是GO通路中第三显著的遗传信号。我们查阅了相关文献，前期的研究支持了我们的发现。Lambert和Jones等人都使用ALIGATOR和GenGen软件，并且都用来分析两套AD GWAS数据，但是这两个研究却没有产生一致的结果^[7]。中国科学院的研究人员认为不同的研究可能有共享的遗传通路。为了检验这种假设，他们应用多重遗传通路分析方法，分析了来自法国和美国的AD GWAS数据(9 580个样本)。在KEGG数据库中，发现了一个与阿尔茨海默病高度相关的遗传通路(Cell adhesion molecules，CAM)。在GO数据库，他们重复了这一发现^[7]。进一步我们发现，cell adhesion molecules还参与了好多自身免疫疾病^[8]。

同时，我们发现了AD参与了3条直接与心血管病相关通路，Dilated cardiomyopathy，Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy和Hypertrophic cardiom-yopathy。该结果也进一步验证了早期广东医科大学的发现。研究人员对来自欧洲的14 138个样本(6 399个AD疾病个体和7 739个对照个体)进行了全基因组范围内基于基因和生物遗传通路水平上的分析。利用基因水平上关联检验的方法得到了1 458个显著(P < 0.05)的AD基因。然后采用生物遗传通路分析对1 458个AD相关基因进行KEGG和GO遗传通路注释，结果发现了3个与心血管疾病有关的显著富集的KEGG通路：viral myocarditis (hsa05416), dilated cardiomyopathy(DCM)(hsa05414), hypertrophic cardiomyopathy (HCM) (hsa05410)。因此，本研究中，我们验证支持了dilated cardiomyopathy (DCM) (hsa05414)和hypertrophic cardiomyopathy (HCM) (hsa05410)。

本研究中，进一步发现了显著的代谢GO功能类，进一步支持了早期的研究结果。国外的研究人员Jones等分析了两套AD GWAS数据.识别出25个显著的GO功能类，大部分都与代谢有关^[6]。本研究中，我们选用KEGG通路和GO通路，主要基于以下考虑：KEGG是通过人工文献阅读和提取的生物学知识数据库，没有明显的分层迭代结构^[9]；GO数据库主要是基于计算预测以及人工注释，具有明显的分层迭代结构，而且GO分析假定每个GO功能分类是彼此独立的，只有大约1%的功能分类是经过试验验证的^[10]。因此，这两个数据库形成了很好的补充。

尽管本研究得到了有价值的结果，但仍有其局限性。例如本研究中我们采用了多重检验校正，但是还不足以校正所有的偏倚，研究结果最好需要随机扰动试验。但是目前我们无法获得原始的基因型数据，因此我们后期的研究中还需要获得原始基因型数据，来进一步验证研究结果。