甜瓜蔗糖转化酶基因的密码子偏好性分析

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赵莉, 李思怡, 张立虎, 李冠. 甜瓜蔗糖转化酶基因的密码子偏好性分析[J]. 生物信息学, 2016, 14(2): 71-77. DOI: 10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.02. 复制到剪切板

ZHAO Li, LI Siyi, ZHANG Lihu, LI Guan. Analysis of codon bias of invertase genes in melon(Cucumis melo L.)[J]. Chinese Journal of Bioinformatics, 2016, 14(2): 71-77. DOI: 10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.02. 复制到剪切板

基金项目

国家自然科学基金资助项目(No.31260258)

通信作者

李冠, 男, 教授, 研究方向:植物生物化学与分子生物学; E-mail: guanli@xju.edu.cn

作者简介

赵莉, 女, 硕士, 研究方向:生物化学与分子生物学; E-mail: 1416964466@qq.com

文章历史

收稿日期: 2015-12-22

修回日期: 2016-04-04

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甜瓜蔗糖转化酶基因的密码子偏好性分析

赵莉, 李思怡, 张立虎, 李冠

新疆大学生命科学与技术学院, 乌鲁木齐 830046

收稿日期: 2015-12-22; 修回日期: 2016-04-04

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(No.31260258)

作者简介: 赵莉, 女, 硕士, 研究方向:生物化学与分子生物学; E-mail: 1416964466@qq.com

通信作者: 李冠, 男, 教授, 研究方向:植物生物化学与分子生物学; E-mail: guanli@xju.edu.cn

摘要: 以甜瓜蔗糖转化酶基因序列为材料，研究甜瓜蔗糖转化酶基因密码子偏好性，为改良甜瓜风味与品质提供理论依据。运用在线分析软件CodonW对甜瓜蔗糖转化酶的编码序列(Coding sequence，CDS)进行密码子分析，利用Mobyle在线工具分析同义密码子相对使用度(RSCU)、有效密码子数(ENC)、GC及GC1s、GC2s、GC3s含量。甜瓜蔗糖转化酶基因偏好于以A或T结尾的密码子。密码子ATT、GTT和AGA的RSCU值都大于1，属于共同偏好使用的密码子，而密码子GCG、CGG的RSCU值小于1，属于使用频率较低的密码子。发现密码子偏好性与亲缘关系的远近有一定的关系。要实现目的基因在外源表达系统中的成功表达和提高其表达量，可通过增加目的基因剂量，目的基因密码子优化，改善培养条件等方法实现，其中目的基因密码子优化起到了关键作用。

关键词: 甜瓜蔗糖转化酶密码子偏好性

Analysis of codon bias of invertase genes in melon(Cucumis melo L.)

ZHAO Li , LI Siyi , ZHANG Lihu , LI Guan

College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China

Abstract: The sequence of invertase genes of melon was used for studying the codon bias of invertase genes to provide a basis for the improvement of flavor and quality of melon. The sequence of CDS of invertase genes of melon was analyzed by Codon W program, then the Relative synonymius codon usage (RSCU), Efective Number of Codon (ENC), and the content of GC, GC1s, GC2s, GC3s were analyzed by Mobyle program.The invertase genes of melon preferred to use condons ending with A or T. ATT, GTTand AGA were common preference used codon with RSCU value more than 1.However, GCG and CGG was low frequently used codon with RSCU value less than 1.It is showed that preferences of condon has a certain relationship with genetic relationship.Successful expression of target gene in exogenous gene expression system and enhancement of its expression level were achieved through increasing the dose of the target gene, optimizing the codon of target gene, improving culture conditions and other methods, which the optimization of codon of target gene has played a key role.

Key Words: Cucumis melo L. Invertase Codon usage

甜瓜(Cucumis melo L.)果实中主要含有还原糖(葡萄糖、果糖)和非还原糖(蔗糖)，以及柠檬酸和苹果酸等成分, 不同的糖酸组分及含量形成了不同风味，其中糖酸代谢酶起到了重要作用^[1]。甜瓜果实中积累的糖分主要是蔗糖，而蔗糖的积累又一定受某种特定的代谢机制的调控, 而蔗糖转化酶就是果实中蔗糖代谢相关酶中重要的一种，普遍的存在于酵母、细菌和植物中，在植物糖代谢中发挥着重要的作用，能够不可逆的催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。按亚细胞定位，蔗糖转化酶可分为细胞壁蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶和细胞质蔗糖转化酶^[2]；按最适pH划分，可分为酸性转化酶和中性转化酶。细胞壁蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶归为酸性转化酶，而细胞质蔗糖转化酶归为中性转化酶^[3]。可溶性酸性蔗糖转化酶是一种液泡酶，催化蔗糖水解成己糖，起着调节植物组织中糖的积累和液泡中蔗糖的利用的作用。细胞壁酸性蔗糖转化酶主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以保持库-源之间的浓度梯度^[4]。许多研究证明，植物体内蔗糖转化酶能对碳水化合物的代谢和分配有着调控，进而可以提高瓜果等作物的产量和品质。有关植物蔗糖转化酶方面的研究很多，但在甜瓜方面开展的工作却较少。我国是甜瓜生产大国，甜瓜糖度是一个反应甜瓜成熟度的重要指标，也是决定甜瓜商品等级的重要因素^[5]。曾有研究表明拟南芥花中蔗糖转化酶基因突变后会造成花蜜合成受阻，可溶性糖含量下降^[6]；另有研究者通过RNA干扰的方式抑制了番茄中蔗糖转化酶抑制蛋白，使番茄的蔗糖转化酶的活性增强，果实中的糖分含量显著增加^[7]。这些探索为我们提供了启示，在改良甜瓜风味的研究中，未见对甜瓜糖酸代谢相关酶的密码子使用偏好性进行研究。本实验对甜瓜蔗糖转化酶基因密码子进行探讨研究，以甜瓜蔗糖转化酶基因序列为材料，通过CodonW等软件分析CDS序列，并寻找密码子偏好性规律，为进一步改善甜瓜品质提供理论基础。

1 实验材料与方法 1.1 序列来源

本研究使用的甜瓜蔗糖转化酶编码序列(CDS)来源通过Cucurbit Genomics Database(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)再在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到CDS区，甜瓜蔗糖转化酶在数据库中的登录号及基因类型(见表 1)。

表 1 甜瓜蔗糖转化酶在数据库的登录号 Table 1 Accession number of melon sucrose invertase in the database

1.2 实验所用软件

运用CodonW版本1.4.4(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::CodonW)对甜瓜蔗糖转化酶的CDS序列进行密码子分析，利用Mobyle在线工具(http://mobyle.pasteur.fr)分析同义密码子相对使用度(Relative synonymius codon usage, RSCU)、有效密码子数(Efective Number of Codon, ENC)、GC及GC1s、GC2s、GC3s含量与密码子适应指数(Condon Adaptation Index, CAI)。

同义密码子相对使用度(RSCU)是对同义密码子使用偏好性的评估，定义为某一同义密码子使用次数的观察值与该密码子出现次数的期望值的比值。如果密码子的使用无偏好性，则RSCU值为1；如果某一密码子使用频繁，则RSCU值大于1；如果某一密码子使用频率低，则RSCU值小于1^[8]。有效密码子数(ENC)反映基因密码子使用的偏好程度，取值范围为20(每个氨基酸只使用一个密码子)~61(各个密码子被均衡使用)，其值越小，表明该基因的密码子使用偏好性越强^[9]。可以根据已知高表达基因的序列来估计未知基因密码子使用的偏好性程度。CAI的值在0~1, 如果越高则表明该基因的密码子使用偏好性越强。

利用DNAMAN8软件对甜瓜蔗糖转化酶的CDS序列进行多序列比对，之后对CDS序列用邻接距离矩阵法进行聚类分析。

2 结果与分析 2.1 有效密码子数及碱基组成分析

13条甜瓜蔗糖代谢酶基因的ENC值、GC碱基含量以及密码子第一、第二、第三位的GC碱基含量计算见表 2。结果显示：在13条甜瓜蔗糖转化酶的基因序列中，有9条(2:MU4509、4: MU47159、6:MU51339、7:MU51906、8:MU51981、9:MU53184、10:MU53489、12:MU60417、13:MU65693)基因的ENC值大于50，说明它们的密码子使用偏好性很弱，剩余4条(1:MU43713、3:MU46770、5:MU50786、11:MU59776)基因的ENC值在40.649-49.769之间，为一般偏好性基因。进一步分析13条甜瓜蔗糖转化酶基因GC含量及密码子第一、二、三位的GC含量，发现3条为一般偏好性基因(1: MU43713、3: MU46770、5: MU50786)的GC含量呈现GC1s＞GC2s＞GC3s规律，且它们的GC含量都小于50％，说明这3条甜瓜蔗糖转化酶基因在编码时偏好使用A或T结尾的密码子。8:MU51981、10:MU53489、11:MU59776的GC3s含量都大于GC2s与GC1s，且GC3s含量大于50％，说明这些基因在编码时偏好使用G或C结尾的密码子，其余的基因都偏好使用A或T结尾的密码子(见表 2)。

表 2 13条甜瓜蔗糖转化酶基因的有效密码子数及碱基组成 Table 2 ENC and base composition of 13 sucrose converting enzyme genes from melon

2.2 甜瓜蔗糖转化酶密码子使用特性分析

用CodonW1.4.4软件计算13条甜瓜蔗糖转化酶基因密码子的RSCU值。分析发现，在13条基因中，密码子ATT、GTT和AGA的RSCU值都大于1，属于共同偏好使用的密码子，而密码子GCG、CGG的RSCU值小于1，属于共同使用频率较低的密码子，见表 3。

表 3 13条甜瓜蔗糖转化酶基因同义密码子的相对使用度 Table 3 The relative synonymous codon usage of 13 sucrose converting enzyme genes from melon

氨基酸	密码子	同义密码子相对使用度(RSCU)
氨基酸	密码子	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
Phe	TTT	1	1.2	1.38	1.24	1.38	1.22	1	1.67	1.31	1.04	1.1	1.52	1.27
	TTC	1	0.8	0.62	0.76	0.62	0.78	1	0.33	0.69	0.96	0.9	0.48	0.73
Leu	TTA	1.08	1.45	0.45	0.56	1.15	0.74	1.14	0.2	1.38	0.7	1.03	0.92	1
	TTG	1.8	1.45	1.47	1.89	1.96	1.68	1.71	1	1.38	1.95	1.69	1.12	1
	CTT	1.68	1.18	1.92	0.78	1.27	1.47	1.14	1.8	0.62	0.56	1.41	2.24	1
	CTC	0.96	0.64	0.91	2	0.46	0.74	0.86	2.6	0.62	1.53	0.56	0.92	0.67
	CTA	0.12	0.18	0.34	0.56	0.69	0.84	0.57	0.4	0.62	0.42	0.38	0.71	1.17
	CTG	0.36	1.09	0.91	0.22	0.46	0.53	0.57	0	0.62	0.84	0.94	0.1	1.17
Ile	ATT	1.12	2	1.82	1.44	1.84	1.78	2.5	1.2	1.14	1.16	1.73	1.41	1.38
	ATC	1.03	0.33	0.47	1	0.59	0.84	0.5	1.2	1.34	1.26	0.8	1.22	0.5
	ATA	0.84	0.67	0.71	0.56	0.59	0.38	0	0.6	0.52	0.58	0.47	0.38	1.12
Val	GTT	2.16	1.5	1.67	1.43	2.05	1.28	2.91	1.6	1.88	1.17	1.16	2	1.41
	GTC	0.43	0.67	0	0.83	0.62	0.77	0.73	2.4	0.88	1.25	0.74	1	0.94
	GTA	0.86	0.67	1.17	0.45	0.72	0.94	0	0	0.38	0.5	0.42	0.56	0.71
	GTG	0.54	1.17	1.17	1.28	0.62	1.02	0.36	0	0.88	1.08	1.68	0.44	0.94
Ser	TCT	0.62	1.38	1.57	1.22	1.53	1.39	2.4	1.35	1.2	1.32	0.65	0.69	2
	TCC	0.77	0.69	0	1.44	0	1.5	0	0.97	0.96	0.88	0.98	2.06	0.29
	TCA	1.69	1.27	2.57	1.22	2.17	1.5	0.6	1.35	1.08	1.17	1.53	1.11	0.57
	TCG	0	1.04	0.43	0.89	0.13	0.21	1.2	0.39	0.6	0.88	0.87	0.26	1.43
	AGT	1.85	1.15	0.71	0.89	1.66	0.75	1.2	0.97	1.56	1.02	1.2	1.29	0.57
	AGC	1.08	0.46	0.71	0.33	0.51	0.64	0.6	0.97	0.6	0.73	0.76	0.6	1.14
Pro	CCT	2.13	1.71	1.63	1.3	1.94	0.95	0.5	0	1.55	0.8	1.47	1.21	1.68
	CCC	0.53	0.57	0.3	1	0.13	0.63	0	1.6	0.13	0.8	0.53	0.36	0.63
	CCA	1.07	1.14	2.07	0.6	1.81	0.95	1.5	0.8	1.29	1.4	1.33	1.94	1.26
	CCG	0.27	0.57	0	1.1	0.13	1.47	2	1.6	1.03	1	0.67	0.48	0.42
Thr	ACT	1.86	1.38	1.79	1.54	2.12	1.47	0.95	0.71	1.14	1	1.29	1.14	0.75
	ACC	0.57	0.14	0.69	0.82	0.38	0.32	1.14	0.24	1.14	1	1	1.71	0.5
	ACA	1.29	2.07	1.38	1.23	1.5	1.58	0.76	0.71	1	1.12	1.14	0.38	2
	AGG	0.29	0.41	0.14	0.41	0	0.63	1.14	2.35	0.71	0.88	0.57	0.76	0.75
Ala	GCT	1.64	1.88	1.19	1.3	2	1.82	1.41	1.07	1.71	1.8	1.23	0.89	1.54
	GCC	0.21	0.47	0.76	1.4	0.18	0.82	0.71	1.33	1.14	1	0.92	0.89	0.77
	GCA	1.85	1.29	1.62	0.6	1.82	0.91	1.81	1.07	0.86	0.8	1.33	1.63	1.54
	GCG	0.31	0.35	0.43	0.7	0	0.45	0.71	0.53	0.29	0.41	0.51	0.59	0.15
Tyr	TAT	1.33	1.52	1.16	1.07	1.67	1.19	0.8	0	0.89	0.75	1.3	1.6	1.14
	TAC	0.67	0.48	0.84	0.93	0.33	0.81	1.2	2	1.11	1.25	0.7	0.94	0.86
His	CAT	1.57	1.67	1.82	1.09	1.5	1.12	0	0	0.71	1.12	1.47	0.88	0.5
	CAC	0.43	0.33	0.18	0.91	0.5	0.88	0	2	1.29	0.88	0.53	1.12	1.5
Gln	CAA	0.53	1	1.23	1.41	1.75	1.43	0.5	1	1.27	0.86	1.14	1.6	0.5
	CAG	1.47	1	0.77	0.59	0.25	0.57	1.5	1	0.73	1.14	0.86	0.4	1.5
Asn	AAT	1.56	1.64	1.38	1.2	1.47	0.92	1	0.57	1.1	0.8	1.53	0.9	1.6
	AAC	0.44	0.36	0.62	0.8	0.53	1.08	1	1.43	0.9	1.2	0.47	1.1	0.04
Lys	AAA	1	0.93	1.15	1	1.32	0.91	1.43	1.08	1	0.94	0.72	0.86	1.2
	AAG	1	1.07	0.85	1	0.68	1.09	0.57	0.92	1	1.06	1.28	1.14	0.8
Asp	GAT	1.35	1.46	1.49	1.41	1.76	1.09	1.67	0.73	1.14	1.33	1.43	1.42	1.68
	GAC	0.65	0.54	0.51	0.59	0.24	0.91	0.33	1.27	0.86	0.67	0.57	0.58	0.32
Glu	GAA	1.18	0.88	0.83	1.21	1.03	1.14	1.6	1.5	1.43	0.97	0.73	1.53	0.5
	GAG	0.82	1.12	1.17	0.79	0.97	0.86	0.4	0.5	0.57	1.03	1.27	0.47	1.5
Cys	TGT	1.33	1.67	1.27	1.33	1.6	1.6	1	1.5	0.29	0.86	1.25	0.93	1
	TGC	0.67	0.33	0.73	0.67	0.4	0.4	1	0.5	1.71	1.14	0.75	1.07	1
Arg	CGT	0.26	1.02	0.31	0	0	0.95	3	0.43	0.27	0.46	0.73	0.78	1.5
	CGC	0.26	0	0.92	1.04	0	0	0	1.29	0.27	0	0.29	0.65	0.38
	CGA	0.78	1.02	0.92	1.3	0.3	1.26	1.5	0.86	1.09	0.92	0.59	1.7	1.12
	CGG	0.26	0.59	0.46	0.52	0.3	0.32	0	0.86	0.55	0	0.88	0.39	0.75
	AGA	3.39	1.46	1.85	2.09	4.2	3.16	1.5	1.29	2.18	2.08	2.34	1.57	1.12
	AGG	1.04	1.9	1.54	1.04	1.2	0.32	0	1.29	1.64	2.54	1.17	0.91	1.12
Gly	GGT	1.12	1.63	1.2	1.24	1.62	1.45	1	1	0.46	1.33	1.28	1.02	0.36
	GGC	0.47	0.34	0.5	1.38	0.1	0.51	0.5	1	0.57	0.62	0.72	0.84	1.27
	GGA	1.67	0.95	1.1	0.51	1.81	1.31	2	0	1.94	1.03	1.28	1.4	1.45
	GGG	0.74	1.08	1.2	0.87	0.48	0.73	0.5	2	1.03	1.03	0.72	0.74	0.91
注：方框中的密码子为共同偏好使用密码子，下划线密码子为共同使用频率低的密码子。 Notes:Common preference for the use of codon in the box, the common use of the low frequency of the underline.

表 3 13条甜瓜蔗糖转化酶基因同义密码子的相对使用度 Table 3 The relative synonymous codon usage of 13 sucrose converting enzyme genes from melon

综上所述，在基因工程中可以根据每条甜瓜蔗糖转化酶基因的密码子使用特征来设计基因序列，优化基因密码子，尽量避免使用频率低的密码子，使外源基因在受体物种中能够高效稳定地表达^[10]。

2.3 CDS序列的聚类分析

通过DANMAN将甜瓜蔗糖转化酶基因CDS序列进行聚类结果，结合甜瓜蔗糖转化酶密码子使用特性发现基因密码子偏好性差异大小与亲缘关系远近有关。

前人研究发现在基因类型和功能一定的情况下，进化上亲缘关系较近的作物间，同义密码子的用法相似^[11]，与本研究的结论一致。通过进化树分枝可以看出2和13、1和9、4和6的进化树分枝较近，总变异值差较小，发现在18个氨基酸中有11个氨基酸密码子偏好性相同，其中2与13都为中性转化酶，4与6的最初来源相同，而3和8虽然在进化树一个分枝，但总变异值相差较大，在18个氨基酸中有6个氨基酸密码子偏好性相同。5和11的总变异值差较小，但不在一个进化树分枝，在18个氨基酸中只有1个氨基酸密码子偏好性相同。由此得出总变异值差较小且在同一进化分枝上的密码子偏好性差异最小，其次为在同一进化分枝上但总变异值差较大的密码子偏好性差异较小，总变异值差较大且不在同一分枝的密码子偏好性差异较大(见图 1)。

图 1 13条甜瓜蔗糖转化酶基因的聚类分析 Figure 1 Cluster analysis of 13 sucrose converting enzyme genes from melon 注：数值(黑体数字)是序列变异值，末尾的数值为物种的总变异值。 Notes:The black value is the sequence variation, and the end of the value is the total variation of the species.

3 讨论

糖分含量是衡量甜瓜品质的主要指标之一，而蔗糖的积累是甜瓜果实糖分提高的重要因素^[12]。密码子偏好性在蛋白质的结构功能、生物信息学等研究中有重要的意义，受到了广泛的关注，密码子使用偏好性受很多因素影响，如基因碱基组成、表达水平等^[13-14]。

先前的研究表明禾本科作物少用或避免使用以A或T结尾的密码子，偏好于使用以G或C结尾的密码子，而双子叶作物则相反^[15-17]，这与我们研究的甜瓜蔗糖转化酶基因的偏好性结果一致。甜瓜蔗糖转化酶基因中密码子ATT、GTT和AGA为共同偏好使用密码子，而GCG和CGG为共同使用频率低的密码子。甜瓜蔗糖转化酶基因亲缘关系的远近对密码子偏好性也有一定的影响，亲缘关系越远，基因密码子偏好性差异越大，反之则密码子偏好性差异越小。为了提高外源蔗糖转化酶基因在甜瓜的表达水平，虽然可通过优化目的基因密码子，增加目的基因表达量，但是甜瓜蔗糖转化酶基因的CAI值较低，不易对密码子进行优化。

4 结论

通过分析甜瓜蔗糖转化酶基因的密码子偏好性，发现该基因的密码子的第三位主要偏好以A或T，而较少使用以C或G。共同偏好使用的密码子为ATT、GTT和AGA，而使用频率较低的密码子为GCG、CGG。研究甜瓜蔗糖转化酶密码子使用特性发现基因密码子偏好性差异大小与亲缘关系远近有关。

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