摘要
通过综合生物信息学分析探索系统性红斑狼疮（SLE）与动脉粥样硬化（AS）之间的共享分子机制。GEO数据库获取SLE和AS微阵列数据，选取两种疾病中共享差异表达基因（DEGs）并进行功能分析。Cytoscape软件构建共享DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）及鉴定枢纽基因。外部数据集验证枢纽基因的表达。HMDD数据库筛选出SLE和AS共有miRNA，MiRTarbase数据库预测miRNA的靶基因，MirPath平台进行功能分析。最后，构建miRNA-mRNA网络。共享DEGs富集分析显示，免疫防御和炎症反应可能是SLE和AS的共同特征。共享DEGs的PPI网络鉴定了5个核心基因（IL1B、CCR1、TLR7、C1QB、TLR2）。miRNA-基因网络表明，miR-21-5p可能在SLE和AS之间的共同机制中发挥重要作用。本研究为SLE和AS之间的共同分子机制提供新的视角，为SLE和AS的早期诊断和治疗提供新的生物学靶点。
Abstract
Through comprehensive bioinformatics analysis, the common molecular mechanisms between systemic lupus erythematosus (SLE) and atherosclerosis (AS) were explored. The microarray data of SLE and AS in the GEO database were obtained. The differentially expressed genes (DEGs) common to these two diseases were selected for functional analysis. Cytoscape software was used to build a protein-protein interaction network (PPI) for the common DEGs and identify hub genes. Hub genes expression was validated in external datasets. The common miRNAs in SLE and AS were screened from the HMDD database and their target genes were predicted using the MiRTarBase. MirPath platform was used for functional analysis. Finally, a miRNA-mRNA network was constructed.Enrichment analysis of common DEGs revealed that immune defense and inflammatory response may be common features of SLE and AS. 5 core genes (IL1B, CCR1, TLR7, C1QB, TLR2) were identified from the PPI network of common DEGs. The miRNA-gene network showed that miR-21-5p might play an important role in the common mechanisms of SLE and AS. This study provides new perspectives for the common molecular mechanism of SLE and AS, and new biological targets for the early diagnosis and treatment of SLE and AS.
Keywords
系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）通常具有广泛的心血管合并症，SLE患者发生心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）及CVD相关死亡风险显著增加[1-3]。加速的动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）被认为是引发SLE相关CVD的根本原因。流行病学研究发现SLE患者发生亚临床AS的风险与其他引发CVD的高危疾病（如糖尿病和类风湿关节炎）相当[4-6]。
吸烟、高胆固醇血症及高血压等传统危险因素并不能完全解释SLE患者AS发生风险的增加[7]。目前研究表明，SLE和AS共享多种免疫环境，涉及血小板和补体活化[8]、中性粒细胞失调和中性粒细胞胞外陷阱形成[9]、自身抗体的产生和免疫复合物形成[10-11]等多种病理学过程。这些发现表明共同的免疫环境及危险因素的相互作用对SLE和AS的发展产生影响，但这种风险背后的分子基础仍未阐明。
生物信息技术的飞速发展有助于从基因层面更全面和深入的探究疾病的发病机制。本研究通过鉴定SLE与AS之间的共享差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）和miRNA，识别核心基因，分析共享DEGs及miRNA的功能，构建miRNA-基因的调控网络，为SLE和AS的诊断和治疗提供新的见解。
1 材料与方法
1.1 数据获取
GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）获取GSE211700、GSE81622、GSE100927及GSE43292数据集数据。GSE211700数据集是基于平台GPL20795进行的测序数据分析，共纳入20例SLE患者和10例健康对照。GSE81622数据集是基于平台GPL10558进行的测序数据分析，共纳入30例SLE患者和25例健康对照。GSE100927数据集是基于平台GPL17077进行的测序数据分析，共纳入19例AS患者和18例正常对照。GSE43292数据集是基于平台GPL6244进行的测序数据分析，共纳入32例AS患者和32例正常对照。本研究中，GSE81622及GSE43292用作独立验证数据集。
1.2 筛选DEGs
GEO2R在线分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）分别筛选GSE211700和GSE100927两个数据集的DEGs。Log2|Fold Change|≥1且P≤0.05作为筛选标准。利用R软件中ggplot2包绘制火山图。韦恩图用于划定两个数据集中表达趋势一致的DEGs作为共享DEGs。
1.3 DEGs 的功能及通路富集
GO数据库（http://geneontology.org）从生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）三个层面标注基因功能。KEGG数据库（https://www.genome.jp/kegg）分析基因的信号传导通路。P≤0.05，FDR≤0.25设定为阈值。利用R软件中ggplot2包用于绘制气泡图。
1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（Protein-protein interaction network，PPI）
共享DEGs的PPI网络由STRING（https://string-db.org）在线平台构建。Cytoscape软件用于网络可视化，CytoHubba插件提取PPI网络中前5个基因（degree算法）作为高连通性的关键基因。
1.5 SLE和AS相关miRNA的筛选及功能分析
HMDD数据库（http://www.cuilab.cn/hmdd）获取SLE相关的miRNA和AS相关的miRNA并将两者取交集。根据已发表的文献进一步确定这些miRNA在SLE和AS中的表达，对具有相同表达趋势的miRNA进一步分析。为了探索miRNA的功能，使用mirPath（http://diana.Imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php）进行GO富集分析。P≤0.05，FDR≤0.25设定为阈值。
1.6 构建miRNA-mRNA网络
miRTarbase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）是一个经过实验验证的miRNA-mRNA相互作用数据库，用于预测miRNA的靶基因。miRNA靶基因的预测结果与共享DEGs取交集。Cytoscape用于miRNA-mRNA调控网络的绘制。
2 结果
2.1 SLE和AS中共享DEGs的识别
基于设定阈值的筛选，GSE211700数据集共获得1 912个DEGs，包含608个高表达基因，1 304个低表达基因（图1(a)）。GSE100927数据集共获得574个DEGs，包含154个高表达基因，420个低表达基因（图1(b)）。排除具有相反表达趋势的基因，最终确定了48个共享DEGs，包含 45个低表达基因和3个高表达基因（图1(c)）。
2.2 共享DEGs的功能富集分析
GO分析结果显示，共享DEGs显著富集的生物学过程包括：免疫效应过程、炎症反应、防御反应、免疫反应、白细胞介导免疫、免疫系统过程（图2(a)）。KEGG分析结果显示，共享DEGs主要涉及以下信号通路：补体和凝血级联、Toll-样受体信号通路、SLE趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体信号通路、NOD样受体信号通路（图2(b)）。
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SLE和AS共享DEGs的鉴定
Fig.
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Identification of common DEGs in SLE and AS
注：(a) GSE100927中DEG的火山图；(b) GSE211700中DEG的火山图；(c) GSE100927和GSE211700中重叠DEG的韦恩图。绿点代表下调的基因，红点代表上调的基因，黑点代表没有显著差异的基因.
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共享DEGs的富集分析
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Enrichment analysis of the common DEGs
注：(a) 通用DEG的GO富集分析；(b) 共享DEG的KEGG通路富集分析.
2.3 PPI网络的构建及核心基因的识别
共享DEGs的PPI网络由48个节点和109条边组成（图3(a)）。按照Degree得分排名，选取前5个基因作为核心基因IL1B、CCR1、TLR7、C1QB、TLR2（图3(b)）。
2.4 5个核心基因表达的验证
GSE43292和GSE81622数据集验证5个核心基因IL1B、CCR1、TLR7、C1QB、TLR2的表达水平。在GSE43292中，与正常对照相比，AS组样本中5个核心基因的表达水平均显著上调。在GSE81622中，与正常对照相比，SLE组样本中5个核心基因的表达水平均显著上调（图4）。这些结果与从GSE100927及GSE211700数据集获得的结果一致，进一步表明了5个核心在SLE和AS中的重要性。
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核心基因的鉴定
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Identification of hub genes
注：(a) 共享基因的PPI网络；(b) 从PPI网络鉴定出5个核心基因。随着分数的增加，节点的颜色从黄色变为红色.
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5个核心基因在GSE43292和GSE81622中的表达
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Expression of 5 core genes in GSE43292 and GSE81622
2.5 SLE和AS共同miRNA的鉴定和功能分析
基于HMDD数据库显示86个miRNA与SLE相关，116个miRNA与AS相关。根据数据库提供的已发表文献显示，miR-21-5p、miR-126-3p、miR-142-3p、miR-146a-3p及 miR-155-5p在两种疾病中的表达均下调，而miR-145-5p在两种疾病中的表达均上调。功能富集分析发现这些miRNA参与多种生物过程，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用、TGF-β信号通路、Hippo信号通路受到6个miRNA的共同调控（图5）。有趣的是，富集分析还包括细胞因子-细胞因子受体通路，这表明SLE 和 AS的共同 miRNA 与共享DEGs的功能具有相同点。
2.6 miRNA-mRNA网络的构建
6个miRNA的靶基因的预测结果与共享DEGs取交集。miRNA-mRNA网络包含5个miRNA（miR-21-5p、miR-145-5p、miR-142-3p、miR-146a-3p、miR-155-5p）及9个共享DEGs，其中3个核心基因（IL1B、CCR1、TLR2）（图6）。从网络中可见，miR-21-5p调控3个核心基因，因此，miR-21-5p可能在SLE和AS的共同机制中发挥重要作用。
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miRNA功能富集分析
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The functional enrichment analysis of miRNA
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miRNA-mRNA调控网络
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miRNA-mRNA regulatory network
3 讨论
随着医疗水平的提高，SLE患者的预后得到改善。近年来SLE患者的总死亡率有所下降，但由心血管事件所致的死亡率的降低尚未有系统报道[12-13]。SLE并发心血管事件仍为临床中的关注焦点。本研究旨在通过生物信息学分析微阵列数据以探究SLE与AS之间的共同分子机制。
急性炎症或持续性低度炎症使SLE患者更易发生感染和CVD。在本研究中通过SLE和AS间共有基因PPI网络的构建鉴定出5个核心基因（IL1B、CCR1、TLR7、C1QB、TLR2），这些基因是参与免疫系统调节的重要组成部分。抗炎因子和促炎因子平衡的破坏是引发SLE疾病活动和AS发生的重要影响因素。IL1B编码IL-1β，在AS发生和进展过程中具有多种作用。在AS发生的初始阶段，IL-1β可诱导内皮细胞的炎性反应，增加炎性细胞在血管中的累积及血管内膜的侵入[14]。此外，在实验性晚期动脉粥样硬化中，中和IL-1β可促进单核细胞向低度炎性状态转化，减小硬化斑块，增加血浆中IL-10的表达[15]。近期研究发现，在SLE中活化的血小板通过IL-1β途径诱导内皮细胞活化[16]，这表明IL-1β可能在SLE早发AS中发挥作用。CCR1是β趋化因子受体家族成员，与G-蛋白偶联，介导细胞信号转导，可作为白细胞运输和免疫系统稳态的关键调节因子[17]。研究表明CCL5-CCR1-CCR5轴在早期AS斑块中具有重要作用[18]。SLE相关研究表明CCR1与狼疮皮肤病变及狼疮肾炎相关[19-20]。TLR2和TLR7是Toll like 样受体（TLRs）成员，TLRs的过度激活或功能异常，可诱导免疫功能障碍及免疫耐受受损，这可能引发自身免疫疾病[21]。近年来研究发现，TLR2的多态性与SLE患者血栓形成有关[22]。TLR7与浆细胞样树突状细胞产生干扰素（IFN）密切相关，IFN-1信号在SLE发病机制中具有关键作用[23]。此外，TLRs在感染相关的AS中的不同感染阶段发挥不同作用。肺炎衣原体、牙龈卟啉单胞菌、幽门螺杆菌通过TLR2信号通路激活内皮细胞，艾滋病毒通过TLR7信号通路激活内皮细胞及脂质核心的形成[24]。补体系统的激活可导致内皮功能障碍，这被认为是AS形成和发展的重要机制，目前通过微阵列数据分析发现C1QB是参与AS进展的关键基因[25]。在狼疮性肾炎中C1QB可作为狼疮性肾炎的免疫标志物，并与肾小球滤过率呈负相关[26]。
最后，通过构建SLE与AS共有miRNA与共享基因的网络发现，5个miRNA（miR-21-5p、miR-145-5p、miR-142-3p、miR-146a-3p、miR-155-5p）与共有DEGs有预测性的靶向关系。miR-21-5p与3个核心基因相关，这表明miR-21-5p可能成为SLE并发AS治疗中的关键靶点。以往研究发现，miR-21是巨噬细胞中最丰富的miRNA，它的缺失会促进细胞凋亡、血管炎症及斑块坏死，加速AS的进展[27]。miR-21在SLE中的报道较少，最新研究表明miR-21与SLE线粒体凋亡途径相关[28]。因此，miR-21-5p在SLE相关AS中的作用机制仍需进一步验证。miR-142-3p表达上调与SLE中单核细胞来源的树突状细胞的促炎功能有关[29]。miR-146a在SLE中与IL-1β、IL-6和IL-17的升高及IL-8和TNF-α的降低相吻合，这表明miR-146a对狼疮炎症有双重作用[30]。miR-155参与SLE的发展及炎性反应，miR-155缺乏通过靶向Faslpr/ LPR小鼠的S1pr1可以改善SLE的自身免疫性炎症[31]。
综上所述，本研究通过生物信息学分析鉴定了SLE和AS中的共享DEGs及核心基因，构建了miRNA-mRNA调控网络，为SLE和AS提供了潜在的诊断和治疗靶点。但是，本研究仍存在一些局限性，核心基因及miRNA在SLE与AS中的调节仍需要进一步验证。
