摘要
为探讨失巢凋亡相关lncRNAs（Anoikis-related lncRNAs，ARLs）在头颈鳞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）中的预后价值并构建预后和免疫活性模型，从癌症基因组图谱（The cancer genome atlas，TCGA）数据库下载 HNSCC患者的转录组数据（RNA-sequencing，RNA-seq）和临床资料；利用生物信息学方法筛选预后相关ARLs，构建预后模型并验证其准确性，随后检测其相关免疫浸润情况；最后通过一系列体外实验验证数据库分析结果的准确性。预后模型包括6个ARLs，具有较高的预测HNSCC患者预后效能，可作为HNSCC患者独立预后因素，且该模型可以用来预测患者免疫活性。此外，实时荧光PCR（real-time PCR，RT-PCR）结果与数据集分析结果一致。流式分析结果显示，ARLs显著影响HNSCC细胞失巢凋亡（P<0.01）。研究表明构建的ARLs是一个新且高效的预后和免疫活性预测模型，为失巢凋亡在HNSCC临床预后中的研究奠定基础。
Abstract
To investigate the prognostic value of anoikis-related long non-coding RNAs (ARLs) in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and construct a prognostic and immune activity model, the RNA-sequencing (RNA-seq) and clinical data of HNSCC patients were downloaded from the Cancer Genome Atlas (TCGA) database. Bioinformatics were used to screen for prognosis-related ARLs, construct a prognostic model, and validate its accuracy. Subsequently, we examined the associated immune infiltration. Finally, the accuracy of the database analysis results was verified via a series of in vitro experiments. The prognostic model included 6 ARLs, demonstrated high predictive efficacy for the prognosis of HNSCC patients, serving as an independent prognostic factor. Moreover, this model could be utilized to predict patients' immune activity. Additionally, the results of real-time PCR (RT-PCR) were consistent with those of the dataset analysis. Flow cytometry analysis revealed that ARLs significantly influenced anoikis of HNSCC cells (P<0.01). Our study indicates that the constructed ARLs model represents a novel and efficient prognostic and immune activity prediction tool, laying the foundation for research on anoikis in the clinical prognosis of HNSCC.
Keywords
头颈癌（Head and neck cancer，HNC）目前是世界上第六位最常见的恶性肿瘤，2020年全球诊断超过100万例，新增死亡人数超过50万[1]。在HNC患者中，绝大多数是鳞状细胞癌，占比90%左右[2]。尽管针对头颈鳞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）的综合序列治疗取得重大进展，但HNSCC患者的5年生存率仍然很低[3]。有数据表明，90%的癌症患者死于转移[4]，而在HNSCC中以颈部淋巴结转移最为常见。HNSCC患者一旦发生颈部淋巴结转移其5年生存率会明显降低[5]，因此寻找新型HNSCC患者预后预测方法以便更好的临床决策迫在眉睫。
体内细胞通常依靠紧密黏附于细胞外基质而生存，一旦与细胞外基质脱离失去细胞间联结便会走向死亡。这种细胞死亡形式于1994年被首次命名为失巢凋亡（Anoikis）[6]。而癌细胞转移的前提是它们拥有抗失巢凋亡的能力，帮助癌细胞在循环系统中生存，从而得以扩散转移[7]。长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一种转录长度在200~100 000 nt之间的RNA[8]。现已证明lncRNAs能够参与到调节肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生物学行为中[8]，而近期研究显示失巢凋亡相关lncRNAs（Anoikis-related lncRNAs，ARLs）与多种癌症的预后有关，包括膀胱癌[9]、腺样囊性癌[10]等，然而ARLs在HNSCC中的作用尚不清楚。本研究通过生物信息学方法构建了一个新的ARLs模型，评估其对预后及免疫活性的预测能力。
1 材料与方法
1.1 数据采集
从癌症基因组图谱（The cancer genome atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）获得HNSCC患者的转录组数据（RNA-sequencing，RNA-seq）和临床信息，删除生存状态缺失，生存时间未知或生存时间<30 d的数据，共499例HNSCC和44例健康对照纳入后续分析（TCGA数据库访问时间：2023.12）。基于GeneCards（https://www.genecards.org），得到419个与失巢凋亡相关性分数>0.4的基因。
1.2 ARLs预后模型的构建及验证
利用R语言limma和sva包计算患者失巢凋亡相关基因表达量，通过Pearson相关分析筛选与其共表达的ARLs，筛选条件为|相关系数|> 0.4，P<0.001。在构建模型前，将所有HNSCC患者随机分为实验组和验证组，采用单、多因素COX分析筛选预后相关ARLs，根据多因素COX分析结果，将预后相关ARLs与共表达基因合并，可视化失巢凋亡mRNAs-lncRNAs网络。随后使用 ARLs风险回归系数和表达量，构建公式计算风险评分，得到预后模型，公式如下：
（1）
Coef表示ARLs的风险回归系数，𝑋表示ARLs表达水平，测量每位HNSCC患者的风险评分，并以实验组的中位风险评分值将各组患者分为高风险组和低风险组。
使用R语言surviminer包通过生存分析比较各分组中高低风险组患者的总生存率（Overall survival，OS）；利用R语言timeROC包描绘1，2，3年受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic，ROC）及多因素ROC曲线评估预后模型的准确性；通过单、多因素COX分析鉴定独立预后因子；利用R语言regplot包绘制基于年龄、性别、肿瘤分级、分期和风险评分的列线图。
1.3 免疫细胞浸润评估
采用R语言limma，GSVA，GSEABase，ggpubr和shape2包计算高低风险组之间各免疫细胞类型的相对百分比和免疫功能评分。
1.4 细胞培养
配制含有10%胎牛血清和1%青/链霉素混合液的DMEM完全培养基，将人正常口腔角质细胞HOK，HNSCC细胞Fadu和WSU-HN6细胞分别置于10 cm培养皿中，放置在5%CO2、37°C细胞培养箱中，定期更换培养基。
1.5 Real-time PCR
使用Trizol提取三组细胞的总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix进行Real-time PCR反应。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT方法计算ARLs的相对表达水平。所有引物均由上海生物工程有限公司设计合成，引物序列如表1所示。
1.6 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染
细胞以3 × 105个/孔的密度接种于6孔板中，分为对照组（si-NC）、干扰组（si-AC099850.3-1/2和si-AL512274.1-1/2）。根据说明书推荐siRNA的工作浓度为50 nM，转染试剂为Lipo8000，siRNA序列如表2所示。
1.7 流式细胞术
将转染24 h后细胞收集于1.5 mL离心管中，预冷PBS冲洗2次后，每个样品分别加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD染色15 min，采用Calibur流式细胞仪进行失巢凋亡分析。
表
1
LncRNAs引物序列
Table
1
LncRNAs primer sequence
表
2
SiRNAs引物序列
Table
2
SiRNAs sequence
1.8 统计分析
所有实验至少进行3次，使用GraphPad Prism 8.4.3和R 4.2.2对实验结果进行统计分析。符合正态分布的数据以 𝑥±s 表示，两组间和多组间比较分别使用独立样本 𝑡 检验和方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 数据处理及预后ARLs鉴定
从TCGA下载HNSCC患者的RNA-seq中，通过相关性分析共获得了1 493个ARLs。按照P<0.001以及|log2（Fold Change）|> 1的标准进行筛选共得到484个差异 ARLs。将临床资料完整的499个HNSCC患者随机分为实验组（𝑁=250）和验证组（𝑁=249），两组患者的详细资料见表3，实验组与验证组患者之间各临床特征无明显差异（P>0.05），排除人为分组差异对结果的影响。在实验组中，使用单因素COX分析484个差异ARLs，得到27个ARLs与预后显著相关（图1(a)）。与非肿瘤组织相比，在HNSCC组织中下调的ARLs有1个，上调的ARLs有26个（图1(b)）。多因素COX分析得到与预后显著相关的ARLs有6个（AC099850.3，LINC00958，LINC00926，LINC00460，AL512274.1和LINC01305）（图1(c)）。可视化失巢凋亡mRNAs-lncRNAs网络（图1(d)），其中LINC01305，AC099850.3和LINC00926与更多的失巢凋亡基因共表达。
图
1
筛选预后相关ARLs
Fig.
1
Screening for prognostic ARLs
注：（a）单因素COX分析预后相关ARLs；（b）27个ARLs箱线图（N为非肿瘤组织，T为肿瘤组织）；（c）多因素COX分析预后相关ARLs；（d）失巢凋亡相关mRNAs-lncRNAs桑葚图.
2.2 预后模型的构建与验证
根据公式计算HNSCC患者的风险评分，风险评分=AC099850.3表达量×(-0.334 931 391)+LINC00958表达量×0.010 472 05+LINC00926表达量×(-0.355 487 229)+LINC00460表达量×0.044 275 32+AL512274.1表达量×(-0.798 105 383)+LINC01305表达量×0.338 440 569。
使用实验组风险评分中位值，将实验组、验证组和全部病例分为高风险组和低风险组。根据风险评分对各组患者进行排序（图2(a)），可见高风险组患者均生存状态较差，死亡人数均比低风险组患者多（图2(b)）。ARLs表达热图表明在高风险组中AC099850.3、LINC00926、AL512274.1和LINC01305表达量显著下降，而LINC00958和LINC00460表达量均显著上升（图2(c)）。随后Kaplan-Meier曲线结果表明，实验和全部病例组高风险组OS显著低于低风险组（P<0.001），验证组也得到同样结果（P=0.016）（图2(d)），由此表明预后模型可以较好的区分HNSCC患者的高低风险以便更好的临床决策。
图
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预后模型的构建与验证
Fig.
2
Construction and verification of the prognostic model
注：（a）各组风险评分分布图；（b）各组患者生存状态图；（c）各组预后ARLs表达热图；（d）各组预后模型在高低风险组中的Kaplan-Meier曲线.
2.3 风险评分是HNSCC的独立预后因素
为了进一步验证预后模型的优越性，随后通过连续单、多因素COX分析表明风险评分可以作为HNSCC的独立预后因素（图3(a)~3(b)）（HR=1.913 357 883，95%CI=1.505 346 02-2.431 958 061）。时间依赖性ROC曲线可见1，2和3年OS的曲线下面积值（Areas under the curve，AUC）分别是0.676，0.684和0.658（图3(c)），均大于0.6说明模型较好地预测患者预后。多因素ROC曲线如图3(d)所示，预后模型1年AUC值大于其他任何临床指标的AUC值。随后临床决策曲线（Decision curve analysis，DCA）也表明，与临床指标相比，风险评分确实是一个更好的预后指标（图3(e)）。基于此，根据风险评分、年龄、分级和分期，构建列线图用来预测HNSCC患者1,3和5年的生存率（图3(f)）。综上所述，该模型对预测HNSCC患者预后的优越性，以及基于模型的风险评分可以作为独立预后因素均已得到证实。
图
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HNSCC患者独立预后因素
Fig.
3
Independent prognostic factors of HNSCC patients
注：（a）单因素COX分析；（b）多因素COX分析；（c）1,2,3年的ROC曲线及AUC值；（d）风险评分及临床参数的ROC曲线及AUC值；（e）风险评分与临床参数的DCA曲线；（f）预后相关列线图.
2.4 高低风险组免疫状态差异
首先，使用来自多个平台的数据分析免疫细胞与高低风险组的相关性。结果显示，大多数免疫细胞与低风险组有关（图4(a)）。此外，针对免疫功能也在两组中进行了比较，结果显示除了APC co inhibition，APC co stimulation，CCR，MHC class I和Parainflammation其余免疫相关功能在两组中均有不同程度的差异（图4(b)）。上述结果表明，高低风险组之间的免疫状态存在着很大的区别，低风险组处于较高的免疫浸润状态。此外，在低风险组中，绝大多数免疫检查点也得到了更好的激活（图4(c)），这意味着面对HNSCC患者，可以按预后模型进行分组，以选择合适的免疫检查点抑制剂。综上所述，针对HNSCC患者开展个体化免疫治疗是很有必要的。
2.5 细胞中ARLs的表达水平
为了进一步验证6种ARLs的表达水平，随后通过RT-PCR评估它们在正常和HNSCC细胞的表达。如图5和表3所示，与正常细胞系（HOK）相比，AC099850.3、LINC00958、LINC00926、LINC00460、AL512274.1和LINC01305的表达量在HNSCC细胞系（Fadu和WSU-HN6）中均显著上调（P<0.01）。因此，6种lncRNAs的表达水平与模型分析结果一致，验证了前文分析结果的准确性。
图
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高低风险组免疫细胞浸润和免疫功能差异
Fig.
4
Differences in immune cell infiltration and immune function between high-and low-risk groups
注：（a）HNSCC患者高低风险组免疫细胞浸润热图；（b）HNSCC患者高低风险组免疫功能比较；（c）HNSCC患者高低风险组免疫检查点的表达差异.
表
3
HOK，Fadu和WSU-HN6细胞中6个ARLs的相对表达水平/ 𝑥±s
Table
3
Relative expression levels of six ARLs in HOK, Fadu, and WSU-HN6 cells / 𝑥±s
2.6 ARLs在体外促进HNSCC细胞失巢凋亡
通过在低吸附板中培养WSU-HN6细胞阻止其黏附以模拟细胞体内生长环境，从而验证ARLs和失巢凋亡的相关性。先在WSU-HN6细胞中敲低AC099850.3和AL512274.1表达，使用RT-PCR检测敲低效率，结果证明敲低ARLs细胞模型成功构建（图6）。随后将敲低ARLs表达的细胞悬浮培养24 h，收集细胞进行流式分析。与si-NC组相比，AC099850.3和AL512274.1敲低组的失巢凋亡细胞比例显著增加（图7）（P<0.01）。由此初步表明，ARLs在HNSCC中的过表达可以显著增强肿瘤细胞的失巢凋亡抗性。
图
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细胞系中ARLs的表达水平
Fig.
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Expression levels of ARLs in HNSCC cell lines
图
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WSU-HN6细胞敲低效率验证
Fig.
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WSU-HN6 cell knockdown efficiency verification
表
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HNSCC患者的临床病理特征
Table
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Clinicopathological features of HNSCC patients
3 讨论
HNSCC的预后取决于多种因素，包括年龄、生活习惯、治疗方法[11]等，有效的生存预测指标对于治疗决策的帮助很大。TNM分期目前是公认的HNSCC患者预后预测模型[11]，但其N分期只考虑阳性淋巴结的数目和大小，会受到颈淋巴清扫类型和切除淋巴结总数的影响[12]。因此，随着对HNSCC认识不断加深，建立基于肿瘤转移的预后评估模型对于术后患者观察和指导临床用药至关重要。尽管目前有一些研究探索失巢凋亡与HNSCC的关系，但没有研究将ARLs作为预测HNSCC患者预后的指标。通过TCGA数据库可以快速获得大量患者的临床及基因表达信息，为探究疾病预后及发生发展提供便捷途径[13]。因此，在本研究中利用TCGA数据库探讨ARLs在预后中的作用并构建预后模型。在之后的验证实验中也表明根据预后模型得到的风险评分是HNSCC的独立预后因素，对于预测HNSCC患者预后具有较高准确性。
图
7
各组WSU-HN6细胞失巢凋亡水平
Fig.
7
Anoikis level of WSU-HN6 cells in each group
据报道LINC00958与膀胱癌[14]和口腔鳞癌[15]等多种肿瘤发生发展有关。LINC00460也在近年来逐渐发现参与肿瘤的进展中，包括胰腺导管癌[16]、舌鳞癌[17]等。研究发现，食管鳞癌中LINC01305通过调控HTR3A促进癌细胞的转移和增殖[18]。除此之外，LINC01305通过不同的途径调控宫颈癌[19]、肺癌[20]的上皮间充质转化。AC099850.3，LINC00926和AL512274.1在实体瘤中的研究较少，但是不同的研究表明它们在癌症中有潜在的预后价值（AC099850.3[21]在非小细胞肺癌，LINC00926[22]在透明细胞肾细胞癌，AL512274.1[23]在口腔鳞癌）。本研究通过体外转染AC099850.3和AL512274.1后流式分析证明抑制二者的表达可以增加肿瘤细胞凋亡，减弱失巢凋亡抵抗。此外，这6个lncRNAs与许多失巢凋亡基因共表达，并且属于已鉴定的lncRNAs。由此充分表明ARLs在HNSCC进展及预后中发挥重要作用。
根据目前的研究，肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）为肿瘤进展和转移提供了有利环境[24]。因此，考虑到TME可以调节失巢凋亡抗性，本研究中进行了ssGSEA来探索高低风险人群的免疫状态。免疫功能（检查点，细胞溶解活性，HLA，炎症促进，T细胞共抑制，T细胞共促进，I型和II型IFN反应）和免疫检查点（不包括CD276，CD44和TNFSF9）在低风险组中更活跃。这些结果也充分表明本研究构建的预后模型与免疫活性相关，迄今为止，已有多项关于失巢凋亡与肿瘤免疫关系的研究，然而这些研究成果不足以确定二者之间的确切关系，需要更多的研究来阐明失巢凋亡在肿瘤免疫中的具体作用。结果中可以看到在低风险组中富集的通路主要是T、B细胞受体（TCR，BCR）信号通路。TCR是T细胞表面能够特异性识别抗原的分子，决定了T细胞的多样性[25]。T细胞抗原受体启动的信号传导是T细胞激活的核心，而T细胞的激活是获得性免疫系统发挥作用的必要条件。当CD4+T细胞和CD8+T细胞被激活时，就会启动TCR信号通路，使得机体做出相应的免疫应答反应[24-25]。BCR是B细胞表面能够特异性识别抗原的分子，它与抗原结合产生的激活信号是B细胞活化的第一信号，调控B细胞的基因转录[26]。由此表明，低风险组的HNSCC患者中获得性免疫系统要比高风险组的HNSCC患者活跃，具有更强的免疫活性。综上所述，可以利用ARLs的风险评分来有效区分HNSCC患者免疫浸润状态，从而指导临床治疗，并为改进未来的免疫治疗和寻找合适的目标人群提供证据。
总之，本研究为探索ARLs在HNSCC发展与转移过程中的作用提供了新角度并构建了一个准确性较高的模型来预测HNSCC患者预后。但该模型来源于公共数据库分析，还需在临床HNSCC患者中进一步探讨其适用范围与准确性，并且需要进一步进行体内外研究以明确ARLs在HNSCC发生发展中的作用及具体机制。综上所述，ARLs预后模型有望成为HNSCC诊疗决策的新型生物标志物，ARLs可作为减少HNSCC转移的药物开发靶点。
