摘要
利用生物信息学方法,获取高血压肾病（Hypertensive nephropathy ，HN）和颈动脉粥样硬化（Carotid atherosclerosis，CA）的关键基因和相关通路。从基因表达综合数据库（GEO）获取HN（GSE37455）和CA（GSE100927）数据集，采用R语言分析差异表达基因。通过Gene Ontology（GO）功能注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析，对共有差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）进行功能富集分析。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并采用Cytoscape软件中的CytoHubba插件筛选Hub基因。进一步分析Hub基因的转录因子-微小RNA-信使RNA（TF-miRNA-mRNA）调控网络及共表达网络，并使用GSE37460和GSE28829数据集进行外部验证。获得HN-CA 49个共同DEGs（21个上调基因和28个下调基因），这些基因通过参与炎症和免疫、细胞增殖、血管重塑、细胞外基质以及细胞膜结构和功能在这两种疾病中发挥至关重要的作用。确定MMP9、BIRC5、SPP1、TREM2、CENPM、CCNB2及OLFML3七个hub基因。其中MMP9、BIRC5、SPP1及CCNB2为主要转录因子，并确定了转录因子、miRNAs及mRNAs之间的共表达网络。外部数据集验证结果与初步筛选结果一致，支持研究结论的可靠性。本研究通过生物信息学分析初步揭示了HN-CA可能共享的分子机制；识别了一系列关键基因及其调控网络。这些发现为后续的实验研究提供了潜在的靶点和方向。
Abstract
This study aims to identify key genes and related pathways shared between hypertensive nephropathy (HN) and carotid atherosclerosis (CA) using bioinformatics approaches.Gene expression profiles of HN (GSE37455) and CA (GSE100927) were retrieved from the Gene Expression Omnibus (GEO) database, and differentially expressed genes (DEGs) were analyzed using R software. Gene Ontology (GO) functional annotation and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis were performed to explore the functional enrichment of the common DEGs. A protein-protein interaction (PPI) network was constructed using the STRING database, and hub genes were identified via the CytoHubba plugin in Cytoscape software. Further analysis of transcription factor-microRNA-messenger RNA (TF-miRNA-mRNA) regulatory interactions and co-expression networks of the hub genes was conducted. External validation was performed using the GSE37460 and GSE28829 datasets.A total of 49 common DEGs (21 upregulated and 28 downregulated) were identified between HN and CA. These genes play critical roles in both diseases by participating in inflammation and immune responses, cell proliferation, vascular remodeling, extracellular matrix organization, and cellular membrane structure and function. Seven hub genes—MMP9, BIRC5, SPP1, TREM2, CENPM, CCNB2, and OLFML3—were identified, among which MMP9, BIRC5, SPP1, and CCNB2 function as key transcription factors. A co-expression network involving transcription factors, miRNAs, and mRNAs was established. The external validation results were consistent with the initial screening findings, supporting the reliability of the study conclusions.This study preliminarily reveals potential shared molecular mechanisms between HN and CA through bioinformatics analysis. Moreover, a set of key genes and regulatory networks were identified, providing potential targets and directions for further experimental research.
高血压肾病（Hypertensive nephropathy，HN）和颈动脉粥样硬化（Carotid atherosclerosis，CA）是两种对公共卫生有重大影响的常见疾病。HN是一种由长期高血压引起的肾脏疾病，是全球终末期肾衰竭的主要原因之一[1]。其特征是肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化和动脉壁玻璃样变性，最终导致肾衰竭[2]。颈动脉疾病是中风风险的重要因素，其特征是颈动脉中斑块积聚，导致血管狭窄和血液循环减少[3]。这两种疾病具有相似的风险因素，如高血压、血脂异常、糖尿病和吸烟等，这表明它们可能存在共同的致病过程[4-6]。高血压和冠状动脉疾病存在许多有害过程，如炎症、氧化应激、血管内膜功能障碍和血管结构改变[7-8]，这些都在两种疾病的进展中发挥作用。为确定HN和CA的治疗靶点，明确其致病分子通路至关重要。
本研究通过GEO数据库获取了HN（GSE37455）和CA（GSE100927）两个数据集。通过对HN和CA中共同表达基因进行差异表达分析；蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络筛选基因，CytoHubba筛选hub基因，构建调节疾病的互作网络，旨在通过基因表达谱的生物信息学分析，确定这两种疾病之间的共同分子特征和通路（图1，研究流程图）。
图
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研究设计流程图
Fig.
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Study design flowchart
1 资料与方法
1.1 数据收集
数据来源于GEO数据库[9]，分别用“高血压肾病”和“动脉粥样硬化”为检索词进行检索。选择标准要求数据样本量不少于10个（对照组5个，病例组5个），标本为人组织，最终选取数据集GSE37455[10]和GSE100927[11]，它们分别使用了Affymetrix GPL14663和Affymetrix GPL17077平台。GSE37455数据集包括25个HN样本和9个对照样本（CN），而GSE100927包含29个颈动脉（AA）样本和35个对照动脉（CA）样本。
1.2 数据集差异表达基因（DEGs）的筛选
采用R软件（v3.4.2）实施数据标准化，设定P<0.05且|Log2fold change|≥1.5为筛选标准，分析GSE37455与GSE100927数据集以识别差异性表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）。通过火山图直观展示差异情况，并利用韦恩图确定两数据集DEGs的重叠部分，这部分基因即为HN-CA疾病状态下特异性表达差异的基因。
1.3 差异表达基因（DEGs）的功能注释与代谢途径解析
采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对筛选出的共同差异表达基因（DEGs）深入进行GO功能注释与KEGG通路富集分析，设定显著性阈值为P<0.05，随后利用仙桃在线平台（https://www.xiantaozi.com）可视化结果，生成柱状图与气泡图，直观展示DEGs的生物学功能与潜在调控网络。
1.4 基于蛋白质相互作用网络的HN-CA核心基因识别与功能模块解析
借助STRING[12]（版本11.5(http://string-db.org）数据库构建蛋白互作网络（PPI），设定互作评分阈值大于0.15以精炼网络并剔除孤立蛋白。随后，利用Cytoscape 3.9.0(http://www.cytoscape.org)软件对PPI网络进行可视化，并采用MCODE算法识别关键功能模块，设置K-core=2、度截断=2、最大深度=100及节点得分截断=0.2作为筛选标准。进而，通过cytoHubba插件的Degree算法确定连接度最高的前10个基因为Hub基因，设定综合得分>0.4为显著性阈值[13]。最终，将选定的Hub基因上传至GeneMANIA数据库，进行深入的蛋白互作分析，构建并展示详尽的蛋白质相互作用网络图，以揭示HN-CA疾病的核心基因及其功能模块。
1.5 Hub基因的识别和构建共表达网络
通过Cytoscape中的cytoHubba插件获取Hub基因。通过六种标准算法（包括MCC、MNC、Degree、Closeness、Radiality及EPC）来评估和识别Hub基因。再利用GeneMANIA(http://www.genemania.org/)[14]构建了这些Hub基因的共表达网络。
1.6 转录因子、miRNA与mRNA间的调控网络机制
为深入探究Hub基因的调控机理，利用TRRUST数据库[15]分析转录因子（TF）与其靶基因间的相互作用，并预测TF间的调控网络。同时，基于Mirwalk数据库[16]，筛选经实验验证或跨平台预测的miRNA-靶标关系。随后，整合上述TF-基因与miRNA-基因互作数据，借助Cytoscape软件构建TF-miRNA-mRNA综合调控网络，从而全面解析Hub基因在HN-CA中的多层次调控机制。
1.7 验证hub基因
为进一步验证 Hub 基因的差异表达情况，利用外部独立数据集 GSE37460 和 GSE28829 进行验证，并采用独立样本 t 检验对其表达水平进行统计学分析。其中，GSE37460 数据集包含 9 例健康对照（Healthy control，HC）样本和 15 例高血压肾病（Hypertensive nephropathy, HN）样本；GSE28829 数据集包括 13 例早期颈动脉粥样硬化（Early carotid atherosclerosis，EA）样本和 16 例晚期颈动脉粥样硬化（Advanced carotid atherosclerosis，CA）样本。所有基因表达数据均经过标准化处理，并采用 t 检验评估 Hub 基因在不同组间的表达差异，以P<0.05 作为统计学显著性阈值。
2 结果
2.1 HN-CA差异表达基因的获取
在深入分析基因芯片GSE37455与GSE100927的数据后，识别出GSE37455中实验组与对照组间存在945个显著DEGs（图2(a)），而GSE100927则揭示了893个DEGs（图2(b)）。通过交集分析，筛选出两数据集共有的49个DEGs，作为HN-CA中的关键差异表达基因，其中上调21个（图2(c)），下调28个（图2(d)），这些发现通过维恩图与火山图可视化展示。
2.2 HN-CA分析数据集DEGs的GO和KEGG富集分析
针对HN-CA数据集筛选出的共表达差异表达基因（DEGs）进行了深入的GO与KEGG富集分析。GO分析揭示，上调基因主要参与炎症和免疫（P=5.23×10-37）、细胞膜结构和功能（P=5.21×10-35）、细胞外基质（P=4.43×10-28）、细胞外囊泡（P=4.16×10-19）及细胞膜过程（P=8.15×10-15）（图3(a)）。下调基因主要涉及细胞增殖和炎症反应（P=7.85×10-5）、DNA结合的调节（P=1.0×10-4）、血管重塑（P=1.0×10-4）和膜衣（P=2.1×10-3）（图3(b)）。KEGG通路分析，上调基因与自噬的控制（P=5.37×10-20）、结核病（P=6.59×10-20）和破骨细胞分化（P=1.75×10-17）显著相关（图3(a)）。下调基因在MAPK信号通路（P=2.0×10-3）、脂肪细胞中脂肪分解的调节（P=3.0×10-3）和PPAR信号通路（P=6.0×10-3）中表现出富集（图3(b)）。
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使用火山图和维恩图来可视化数据
Fig.
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Visualization of data using volcano plot and venn diagram
注：（a）GSE37455的火山图；（b）GSE100927的火山图，其中浅红色表示上调基因，浅蓝色表示下调基因。两个数据集重叠了49个差异表达基因（DEGs），包括21个上调基因（c）和28个下调基因（d）.
2.3 HN-CA分析数据集DEGs的PPI网络构建和Hub筛选
利用STRING数据库构建DEGs的PPI网络，设定置信度阈值（>0.4），生成包含26节点、49条边的互作图谱（图4(a)）。随后，在Cytoscape中运用MCODE插件，识别出一个核心基因模块，该模块由7个关键DEGs及9项强相互作用构成，呈现一个基因互作网络（图4(b)）。
2.4 筛选Hub基因
通过cytoHubba的六种算法综合评估，筛选出前10大Hub基因（表1）。韦恩图分析显示，MMP9、BIRC5、SPP1、TREM2、CENPM、CCNB2及OLFML3 7个基因作为核心Hub基因重叠出现（图5(a)）。表2详细列出了这些基因全称及其功能。GeneMANIA分析揭示，这些Hub基因构成了一个错综复杂的网络，以共表达（78.52%）为主，辅以物理互作（15.1%）与通路关联（6.32%），进一步强化了其关键角色（图5(b)）。
2.5 转录因子、miRNA和mRNA调控网络
通过TRRUST和Mirwalk数据库，确定了8个转录因子和5个microRNA，它们具有控制基因表达的潜力。我们组合了11对miRNA-mRNA和19对TF-mRNA，形成了一个转录因子、miRNA和mRNA的调控网络（图6）。
图
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差异表达基因的GO和KEGG富集分析
Fig.
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GO and KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes
注：（a）上调差异表达基因的GO和KEGG富集分析；（b）下调差异表达基因的GO和KEGG富集分析，数据来源于DAVID数据库.
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PPI网络构建
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Construction of the protein-protein interaction (PPI) network
注：（a）使用STRING数据库构建的PPI网络；（b）高血压肾病和颈动脉粥样硬化中的关键重叠基因，颜色较深的（红色）节点表示度值较高；颜色较浅的（黄色）节点表示度值较低.
表
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在cytoHubba中，排名前10 Hub基因
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Top 10 Hub genes identified by cytoHubba
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Hub基因详细信息
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Detailed information of Hub Genes
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韦恩图和网络图展示Hub基因的共表达
Fig.
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Venn diagram and network diagram displaying the co-expression of Hub genes
注：韦恩图（a）说明六种不同算法识别的7个Hub基因的重叠情况，使用GeneMANIA（b）工具分析了核心基因的共表达网络.
2.6 hub基因表达的验证
利用 GSE28829 和 GSE37460 数据集对筛选出的Hub基因进行外部验证。结果显示，与EA相比，MMP9、BIRC5、SPP1、TREM2、CENPM 及 CCNB2 基因在CA中显著上调，差异具有统计学意义（图7(a)）。同时，与HC相比，HN患者中BIRC5、CCNB2 及 OLFML3 基因的表达均显著下调（图7(b)）。
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TFs-miRNA-mRNA调控网络
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TFs-miRNA-mRNA regulatory network
注：Hub基因用红色节点表示，miRNA用蓝色三角形表示，转录因子用橙色三角形表示.
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（a）GSE28829和（b）GSE37460数据集中hub基因的表达情况
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Expression of Hub genes in the (a) GSE28829 and (b) GSE37460 Datasets
注：* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001；**** P<0.0001.
3 讨论
大量研究表明，HN和CA与全球心血管疾病的发病率和死亡率密切相关[17-19]。HN由长期未控制的高血压引起，导致肾小球损伤、蛋白尿和肾小管间质纤维化，并最终进展为终末期肾病（End stage renal disease，ESRD）。CA 主要表现为颈动脉粥样硬化斑块的形成，显著增加中风、短暂性脑缺血发作（Transient ischemic attack，TIA）及其他心血管不良事件的风险。尽管二者的临床表现不同，但越来越多的证据表明，HN 和 CA 可能共享某些致病机制，包括慢性炎症、细胞增殖失调、细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）重塑、氧化应激以及细胞周期异常调控。
本研究利用生物信息学方法，分析了HN和CA患者的共有DEGs。鉴定出 21个共同上调基因和 28 个共同下调基因。并发现这些基因主要涉及炎症反应、细胞外基质调节、胆固醇代谢、血管平滑肌细胞迁移等生物学过程。进一步通过PPI网络分析，鉴定出7个核心 Hub 基因（MMP9、BIRC5、SPP1、TREM2、CENPM、CCNB2 和 OLFML3）。这些基因可能在HN和CA的发生发展过程中发挥关键作用。此外，本研究还构建了HN-CA相关的TF-miRNA-mRNA调控网络，揭示了BIRC5、CCNB2、SPP1和MMP9等Hub基因在疾病发生中的潜在作用。这些基因可能通过与特定miRNA和转录因子的相互作用，参与细胞增殖、凋亡、炎症反应及ECM重塑等过程。
BIRC5（亦称Survivin）是一种具有抗凋亡蛋白质，在多种疾病，尤其在癌症的中发挥重要作用。研究表明，BIRC5不仅调控炎症反应，还促进细胞增殖和迁移[20-22]。在HN和CA中，BIRC5 可能通过抑制细胞凋亡，导致异常细胞增殖和延长细胞存活时间，从而加重组织损伤并加速疾病进展[23-24]。其表达增加可激活NF-κB和MAPK信号通路，促进炎症反应，加重组织损伤[25]。此外，BIRC5还增强细胞增殖和迁移能力，在HN中，TP53RK/Birc5信号轴的异常激活可能会破坏肾小管细胞和成纤维细胞的正常表型，加速慢性肾脏疾病进展[26]。小鼠模型研究也发现，BIRC5 过表达可显著上调细胞周期蛋白、Survivin mRNA 和蛋白水平，增强细胞增殖、侵袭及迁移能力[27]。在CA中，BIRC5 可能通过促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移，加剧动脉粥样硬化斑块的形成及不稳定性。在GSE37460 数据集中，HN患者的肾小球组织中BIRC5表达水平低于健康对照组，这可能是基因的代偿性调节，以减少肾小球细胞的凋亡并避免过度的炎症反应。综上，BIRC5在HN和CA 的病理机制中起着重要作用，主要通过抗凋亡、促炎及促增殖途径介导疾病进展。
MMP9（基质金属蛋白酶-9），亦称胶原酶IV或明胶酶B，属于基质金属蛋白酶（MMPs）家族，主要参与ECM的降解，在组织重塑和修复过程中发挥关键作用。研究表明，MMPs通过激活内皮细胞[28]、降解动脉壁ECM[29]，以及调控氧化应激、血管炎症和平滑肌细胞凋亡[30]，在动脉粥样硬化的发生和进展中具有重要作用[31-32]。此外，MMPs在肾脏疾病的血管重塑中同样发挥关键作用[33-36]，加速HN的进展。动物实验表明，敲除MMP9可恢复肾血流的自动调节，并防止肾间质纤维化的发生[37]。综上，MMP9通过ECM降解、炎症促进、细胞凋亡调控及血管重塑等机制，在CA和HN的发展中发挥重要作用，这些病理过程可能相互作用，共同影响两种疾病的进程。
SPP1基因编码分泌型磷酸蛋白1，是一种广泛表达于骨骼、肌肉和免疫系统中的糖蛋白。近期的生物信息学分析已将SPP1确认为动脉粥样硬化中治疗冠状动脉疾病的关键基因[38]。单细胞RNA测序研究表明，SPP1与动脉炎症、脂质代谢、晚期动脉粥样硬化以及胶原分解等过程密切相关[39]，并且在人类组织单细胞测序中被确认是动脉粥样硬化的关键基因[40]。此外，肾脏组织生物学测序也表明，SPP1是慢性肾病中肾纤维化的潜在诊断生物标志物[41]。
TREM基因家族编码位于细胞表面的受体，主要在髓系细胞中表达。近期研究发现，尿液中的TREM-1/TREM-2比值可作为慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease, CKD）患者肾纤维化的生物标志物[42]。此外，TREM基因与动脉粥样硬化之间也存在相关性，尤其是在Mif缺陷型动脉粥样硬化小鼠的颈动脉转录组数据中得到了证实[43]。因此，TREM基因与HN-CA之间具有显著的关联。然而，CENPM、CCNB2和OLFML3在HN-CA的发病机制中的作用尚不明确，未来需要更多数据进行深入分析。
本研究鉴定的7个核心hub基因在HN-CA中表现出差异表达，具有作为潜在生物标志物或治疗靶点的潜力。例如，MMP9在CA中的上调可能有助于早期诊断和疾病监测；BIRC5在HN中的下调可能提示其肾脏保护作用；SPP1的差异表达可为疾病分层和靶向治疗提供依据。此外，TREM2、CENPM、CCNB2和OLFML3在免疫调节、细胞周期调控及组织修复中的作用，为早期干预和治疗提供了新思路。这些基因的表达可通过血液检测或组织活检监测，为临床诊断、风险评估和个性化治疗提供支持。本研究的不足之处在于，我们的分析仅基于基因芯片数据，缺乏实验验证。因此，未来需要开展更全面的基础和临床研究，以揭示这些疾病中已确定的Hub基因和信号通路的变化，特别是此前未与这些疾病相关联的基因。深入探讨HA-CA之间的相互作用，对于理解其发病机制至关重要。
4 结论
1）本研究鉴定了与HN和CA相关的21个上调基因和28个下调基因，揭示了炎症反应、ECM重塑等生物学过程在两者发病机制中的作用；
2）通过PPI网络分析，识别了7个潜在的Hub基因（MMP9、BIRC5、SPP1、TREM2、CENPM、CCNB2、OLFML3），为理解两种疾病的共同机制提供了新视角；
3）基因网络分析进一步揭示了BIRC5、CCNB2、SPP1和MMP9等基因在HN和CA中的潜在作用，为靶向治疗和生物标志物的开发提供了理论基础。
