摘要
结直肠癌是全球第三大常见癌症，其肝转移显著影响患者预后，本研究通过生物信息学手段构建基于circRNA的竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA, ceRNA）网络，探讨其在结直肠癌肝转移中的作用及与免疫浸润的相关性，并寻找潜在的生物标志物。从GEO数据库下载无肝转移和肝转移结直肠癌患者的原位组织基因表达数据，使用R包筛选差异表达基因，包括circRNA, miRNA和mRNA，并通过CSCD数据库预测circRNA-miRNA相互作用，结合miRTarBase和TargetScan数据库预测miRNA-mRNA互作，利用Cytoscape 3.8.0构建ceRNA网络。利用Metascape对差异表达的mRNA进行功能富集分析，并对核心基因进行免疫浸润分析，探索ceRNA网络调控肿瘤进程的免疫机制，最后通过TCGA数据库验证关键基因的表达水平与结直肠癌肝转移的相关性。共筛选出差异表达的109个circRNA，114个miRNA，104个mRNA，构建了含有差异表达的5个circRNA，5个miRNA和4个mRNA的ceRNA网络。GO和KEGG富集分析显示，该网络中mRNA主要参与白细胞活化调节和免疫反应路径。免疫浸润分析表明，4个节点基因的表达水平均与免疫浸润分数呈正相关，其中主要组织相容性复合体II类DR α (Major Histocompatibility Complex、Class II、DR Alpha、HLA-DRA)与其相关性最强。TCGA数据库的进一步验证结果显示HLA-DRA高表达时结直肠癌肝转移率低。本研究提示HLA-DRA可能是预测结直肠癌肝转移的潜在生物标志物，可能为其临床诊断和未来分子靶向药物的开发提供方向。
Abstract
Colorectal cancer is the third most common cancer in the world, and liver metastasis significantly affects the prognosis of patients. In this study, a competitive endogenous RNA (ceRNA) network based on circRNA was constructed by using bioinformatics tools to explore its role in liver metastasis of colorectal cancer and its correlation with immune infiltration, and to find potential biomarkers. Gene expression data of colorectal cancer in situ tissues (no-metastasis and liver metastasis) were downloaded from GEO database, and Differentially Expressed Genes, including circRNA, miRNA and mRNA, were screened using R package. Moreover, circRNA-miRNA interactions were predicted by CSCD database, miRNA-mRNA interactions were predicted by miRTarBase and TargetScan database, and ceRNA network was constructed by Cytoscape 3.8.0. Metascape was used to conduct functional enrichment analyses of differentially expressed mRNA and immune infiltration analysis of core genes to explore the immune mechanisms of ceRNA network regulating tumor progression. Finally, TCGA database was used to verify the correlation between the expression levels of key genes and liver metastasis of colorectal cancer. A total of 109 circRNAs, 114 miRNAs and 104 mRNAs were selected, and constructed a ceRNA network containing 5 circRNAs, 5 miRNAs and 4 mRNAs. GO and KEGG enrichment analysis revealed that mRNA in this network was mainly involved in the regulation of leukocyte activation and immune response pathways. Immune infiltration analysis showed that the expression levels of the four node genes were positively correlated with the immune infiltration score, with the Major Histocompatibility Complex, Class II, DR Alpha (HLA-DRA) having the strongest correlation. Further validation results of TCGA database showed low rates of liver metastasis in colorectal cancer with high HLA-DRA expression. In this study, we initially constructed a circRNA-based ceRNA network related to liver metastasis of colorectal cancer, and found that HLA-DRA was low expressed in patients with liver metastasis of colorectal cancer and was positively correlated with the level of immune infiltration, suggesting that HLA-DRA may be a potential biomarker for predicting liver metastasis of colorectal cancer. It may provide direction for its clinical diagnosis and future development of molecular targeted drugs.
2022年，结直肠癌发病率在全球恶性肿瘤发病率中位居第三（9.6%），其死亡率位居第二（9.3%）[1]；在中国，2022年结直肠癌发病率仅次于肺癌，为第二大恶性肿瘤，死亡率位居第四，新增病例和相关死亡人数均居全球首位[2-3]。近年来，结直肠癌的发病年龄逐渐年轻化[4]，这可能与动物性食物摄入量增加、吸烟酗酒、久坐等不良生活方式有关。此外，我国超过1/2的结直肠癌患者在首次确诊时即为中晚期，由此可见，结直肠癌的预防筛查尤为重要，探索准确、有效的生物标记物用于结直肠癌的早期诊断及预后预测具有重要的临床意义。
随着高通量测序技术的发展和新型生物学方法的应用，circRNA和miRNA已被证明在包括恶性肿瘤在内的多种疾病中扮演着重要角色。不同于其他非编码RNA，circRNA具有共价闭合连续环结构，使其更加稳定且不易被核酸外切酶降解，这赋予了circRNA作为生物标志物的独特优势[5]。此外，circRNA在真核生物中高度富集，并通常显示出组织特异性表达模式，这一特性使得它们成为理想的诊断和预后预测标志物[6-7]。miRNA是一种单链小分子非编码RNA，能够与mRNA碱基配对诱导沉默复合体降解mRNA或阻碍mRNA翻译[8-9]。circRNA通过充当miRNA的“分子海绵”，能够调节基因剪接和转录过程，进而调控miRNA对下游靶mRNA的作用，形成circRNA-miRNA-mRNA相关的竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）网络[10-11]，这种调控机制不仅揭示了非编码RNA之间错综复杂的相互作用，也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新的视角[12]。已有研究表明circRNA参与了多种癌症的发生与发展过程，如肝癌、肺癌等[13-14]，并且一些特定的circRNA可以作为癌症的诊断或治疗靶点[15]，例如，circLPAR1在诊断结直肠癌方面显示出癌症特异性，被确定为结直肠癌诊断的一个潜在生物标志物[16]；circPDE4D、circ-FBXW7为耐药的结直肠癌提供了有效的治疗策略[17]。然而，对于circRNA在肿瘤中的具体调控机制的研究仍不成熟，尤其是circRNA作为ceRNA在结直肠癌进展中的作用研究报道较少，因此，本研究聚焦于circRNA的ceRNA网络分析，深入探讨其在结直肠癌肝转移中的具体作用机制，旨在提出新颖的、可用于结直肠癌肝转移辅助诊断的潜在生物标记物，以期为其靶向防治策略的开发提供新的研究思路与理论依据。
1 材料与方法
1.1 数据来源
应用Strawberry PERL 5.32.0、R 4.0.4软件下载数据、整理和分析。利用GEO数据库下载结直肠癌无肝转移和肝转移的原位组织circRNA，miRNA，mRNA基因表达数据文件及患者临床信息。根据结直肠癌是否肝转移分为结直肠癌无肝转移组和肝转移组。整理、筛选数据，去除一致性较差的样本，进行差异分析。基因表达信息见表1。
表
1
circRNA、miRNA、mRNA微阵列信息
Table
1
Information on the circRNA, miRNA and mRNA microarray
注：𝑛 指从数据库中下载的病例数.
1.2 方法
1.2.1 差异表达基因的筛选
应用R软件LimmaR程序包筛选结直肠癌无肝转移组和肝转移组差异表达的circRNA（Differentially expressed circRNA, DEcircRNA）、差异表达的miRNA（Differentially expressed miRNA, DEmiRNA）和差异表达的mRNA（Differentially expressed mRNA, DEmRNA）。将探针矩阵转换为相应circRNA，miRNA和基因的名称，将circRNA整理成标准的circBase数据库矩阵，以备后续差异分析。以|log2FC|≥2和FDR<0.05为筛选DEcircRNA的阈值；以|log2FC|≥2和FDR<0.01为筛选DEmiRNA的阈值；以|log2FC|≥1和FDR<0.05为筛选DEmRNA的阈值。FC为结直肠癌肝转移组与无肝转移组基因表达量之比。
1.2.2 构建ceRNA网络
检索circBase数据库中circRNA的位置、正负链、长度、转录本、所处基因等相关信息。根据circRNA基本信息在癌症特异的环状RNA综合互作数据库（Cancer specific circRNA database, CSCD）中查找circRNA结构，预测与之结合的miRNA，将结果与DEmiRNA取交集得靶向miRNA。利用miRTarBase和TargetScan数据库，根据靶向miRNA预测与之结合的mRNA，将结果与DEmRNA取交集得靶向mRNA，构建ceRNA网络。利用miRTarBase和TargetScan这两个数据库同时预测miRNA靶向基因，取交集作为本研究认可的预测结果，以保证数据可靠性。
应用Network文件（包含miRNA和与之具有结合关系的circRNA和mRNA）和Node文件（包含ceRNA网络节点和节点属性）构建基于circRNA的ceRNA网络。应用pheatmap包绘制结直肠癌无肝转移组和肝转移组DEcircRNA, DEmiRNA, DEmRNA的热图。应用Cytoscape 3.8.0绘制ceRNA网络。
1.2.3 功能和通路富集分析
应用Metascape对DEmRNA的基因本体（Gene ontology，GO）生物功能、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路进行富集分析，探讨ceRNA网络是否通过免疫机制调控结直肠癌转移肿瘤进程。
1.2.4 免疫浸润水平分析
基于GSE14095数据集，应用cibersoft R包、estimate R包、pROC R包、TIMER网页分析工具等计算结直肠癌无肝转移组和肝转移组免疫浸润分数，绘制ROC曲线，以其作为反映灵敏度和特异度连续变量的综合指标，判断免疫浸润分数对判断结直肠癌肝转移是否有意义。筛选ceRNA网络中基因表达水平与免疫浸润分数相关性较强的节点基因作为靶点基因，绘制ceRNA靶点基因预测肝转移的ROC曲线，对集中大分类免疫细胞进行评分，绘制相关系数矩阵。
1.2.5 TCGA数据库验证
利用癌症基因组图谱(The cancer genome atlas, TCGA)数据库下载结直肠癌RNA-seq数据及相应的临床信息，对前述筛选得到的ceRNA网络中基因表达水平与免疫浸润分数相关性最强的节点基因按表达水平高低进行分组，验证其表达水平与结直肠癌肝转移的相关性。
1.3 统计学处理
计数资料以频数（𝑛）或百分比（%）表示。组间比较采用 𝑡 检验，免疫浸润水平与基因相关性分析采用Spearman检验，两组间频数比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 结直肠癌无肝转移组和肝转移组的基因表达数据分析
对GSE147711数据集做circRNA差异分析，去除一致性较差的样本，筛选出109个DEcircRNA（其中上调61个，下调48个）；对GSE72199数据集做miRNA差异分析，筛选出114个DEmiRNA（其中上调84个，下调30个）。对GSE14095数据集做mRNA差异分析，筛选出104个DEmRNA（其中上调22个，下调82个），见图1。
图
1
结直肠癌无肝转移组和肝转移组circRNA、miRNA和mRNA表达量的热图示意图
Fig.
1
Heatmap of DEcircRNAs，DEmiRNAs and DEmRNAs in colorectal cancer with and without liver metastasis
注：1：无肝转移的结直肠癌原位组织；2：伴肝转移的结直肠癌原位组织。颜色标尺：红色表示表达量上调，蓝色表示表达量下调。(a) circRNA；(b) miRNA；(c) mRNA.
2.2 结直肠癌ceRNA网络构建
检索circBase数据库中circRNA的相关信息，通过CSCD数据库预测与之结合的miRNA。结果显示，去除重复值后共有1 983个miRNA，与DEmiRNA取交集，得到45个靶向miRNA。利用miRTarBase和TargetScan数据库预测与上述45个靶向miRNA结合的mRNA，在两个数据库中结果均显示靶向作用于3 559个mRNA，与DEmRNA取交集，得到9个靶向mRNA。应用Network文件和Node文件构建ceRNA网络，结果显示构建的ceRNA网络中含有5个DEcircRNA（hsa_circ_0062548、hsa_circ_0000467、hsa_circ_0007372、hsa_circ_0004071、hsa_circ_0003180），5个DEmiRNA（hsa-miR-657、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-613、hsa-miR-1281、hsa-miR-3613-5p），4个DEmRNA，包括主要组织相容性复合体II类DR α(Major Histocompatibility Complex、Class II、DR Alpha、HLA-DRA)、TSPAN1、SLC28A2、MT1E。
2.3 GO和KEGG通路富集分析
基于GSE14095对DEmRNA分别做GO和KEGG富集分析。GO分析结果显示，DEmRNA在生物过程中主要参与组织稳态、细胞因子介导的信号通路，与白细胞活化的调节、对细菌的反应高度相关，见图2。KEGG富集分析对差异表达基因进行功能注释，结果显示DEmRNA显著富集于破骨细胞分化、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、类风湿性关节炎信号通路、细胞因子-细胞因子受体信号通路等，见图3。GO和KEGG富集分析结果共同表明，ceRNA网络中节点基因所涉及的通路和生物进程与免疫密切相关。
图
2
结直肠癌中差异mRNA GO分析的生物过程富集条目结果
Fig.
2
Results of biological process enrichment entries for differential mRNA GO analysis in colorectal cancer
2.4 基因的免疫浸润水平分析
基于GSE14095数据集，应用estimate R包、TIMER网页分析工具计算结直肠癌无肝转移组和肝转移组的免疫浸润分数并进行比较。结果显示，结直肠癌无肝转移组患者的免疫浸润分数（548.04±860.50）显著高于肝转移组（-2.67±652.34）（P<0.001），这表明在结直肠癌肝转移过程中可能存在免疫抑制现象，导致免疫细胞对肿瘤的浸润减少，两组间具有显著的统计学差异，此结果提示结直肠癌肝转移或与免疫浸润水平低下相关，见图4。
图
3
结直肠癌中差异mRNA KEGG富集通路结果
Fig.
3
Results of differential mRNA KEGG enrichment pathway in colorectal cancer
图
4
结直肠癌肝转移组和无肝转移组的免疫浸润分数图
Fig.
4
ImmuneScore in colorectal cancer with and without liver metastasis
以免疫浸润分数ROC曲线作为反映灵敏度和特异度连续变量的综合指标，绘制基于免疫浸润分数预测结直肠癌患者是否发生肝转移的ROC曲线。结果显示，免疫浸润分数ROC曲线的AUC为0.692，以免疫浸润分数预测结直肠癌是否肝转移的灵敏度为0.849，特异度为0.507，表明免疫浸润分数虽然不能单独作为绝对的诊断标准，但对判断结直肠癌是否肝转移有一定的准确性，可作为一种有效的工具来辅助判断结直肠癌患者是否有较高的肝转移风险，提示免疫浸润分数在结直肠癌肝转移诊断中的潜在价值，见图5。分析结直肠癌无肝转移组和肝转移组的免疫细胞亚群，结果显示结直肠癌肝转移组中未致敏CD4+T细胞的表达水平显著高于无肝转移组（P=0.031 9）；滤泡辅助性T细胞（P=0.000 5）、活化的树突细胞（P=0.046 9）和中性粒细胞（P=0.008 0）表达水平显著低于无肝转移组，见图6。进一步表明结直肠癌高肝转移性组织中的免疫浸润水平相对较低。
图
5
结直肠癌免疫浸润分数的ROC曲线
Fig.
5
ROC curve of ImmuneScore in colorectal cancer
注：AUC：越接近于1表示模型的区分能力越强；灵敏度：实际患病被正确识别为病人的比例；特异度：实际未患病被正确识别为健康的比例.
2.5 ceRNA网络节点基因与免疫浸润分数的相关性
分析ceRNA网络中的mRNA与免疫浸润分数。结果显示，4个节点基因HLA-DRA基因（r=0.73）、MT1E基因（r=0.42）、TAPAN1基因（r=0.24）和SLC28A2基因（r=0.14）的表达水平与免疫浸润分数均呈正相关（P值均<0.05），见图7。绘制4个节点基因的ROC曲线，预测其与结直肠癌肝转移的相关性，结果显示HLA-DRA基因、MT1E基因、TAPAN1基因和SLC28A2基因预测结直肠癌肝转移ROC曲线的AUC分别为0.702、0.673、0.652和0.588，见图8。
选择与免疫浸润分数相关性最强的HLA-DRA基因，进一步研究其表达水平与免疫浸润的相关性，对GSE14095数据集中大分类免疫细胞进行评分，绘制相关系数矩阵，结果表明，HLA-DRA表达水平与此前筛选的结直肠癌无肝转移组和肝转移组差异表达的免疫细胞丰度呈正相关。见图9、图10。进一步证实HLA-DRA与免疫细胞浸润水平呈正相关。
图
6
结直肠癌无肝转移组和肝转移组免疫细胞亚群分析
Fig.
6
Analysis of immune cell subsets in colorectal cancer with and without liver metastasis
图
7
HLA-DRA、MT1E、TSPAN1、SLC28A2与免疫浸润分数的相关性
Fig.
7
Correlation between HLA-DRA, MT1E, TSPAN1, SLC28A2 expression level and immune score
注：(a)HLA-DRA；(b)MT1E；(c) TSPAN1；(d) SLC28A2.
图
8
HLA-DRA、MT1E、TSPAN1、SLC28A2基因预测结直肠癌肝转移的ROC曲线
Fig.
8
ROC curves of HLA-DRA, MT1E, TSPAN1, SLC28A2 predicted liver metastasis in colorectal cancer
注：(a) HLA-DRA；(b) MT1E；(c) TSPAN1；(d) SLC28A2.
图
9
HLA-DRA基因表达水平与免疫细胞的相关系数矩阵
Fig.
9
Correlation coefficient matrix between HLA-DRA gene expression level and immune cell
图
10
HLA-DRA基因表达水平与免疫浸润水平的相关性
Fig.
10
Correlation between HLA-DRA gene expression level and immune infiltration levels
注：样本：人类结直肠癌原位肿瘤组织；Partial. Cor：偏相关系数；TPM：每百万转录本数；(a) B细胞；(b) CD8+T细胞；(c) CD4+T细胞；(d) 巨噬细胞；(e) 中性粒细胞；(f) 树突状细胞.
2.6 TCGA验证节点基因表达水平与结直肠癌肝转移的相关性
为进一步确定HLA-DRA作为ceRNA网络关键基因参与结直肠癌免疫浸润与转移，使用TCGA数据库下载的结直肠癌 RNA-seq数据验证HLA-DRA基因表达水平与结直肠癌转移的相关性。统计数据包括378例无肝转移和64例肝转移病例，根据中位HLA-DRA表达水平分为HLA-DRA低表达组（221例）和高表达组（221例）。HLA-DRA低表达组结直肠癌患者发生肝转移的比例[25.57%(45/176) ]显著高于HLA-DRA高表达组[9.41%(19/202) ]（=11.419, P<0.001），表明HLA-DRA低表达时结直肠癌组织肝转移性高、免疫浸润水平低，见图11。
图
11
通过TCGA验证HLA-DRA表达水平与结直肠癌肝转移的相关性
Fig.
11
Correlation between HLA-DRA expression level and liver metastasis of colorectal cancer verified by TCGA
3 讨论
近年来，随着高通量RNA-Seq和新型生物学方法的发展，越来越多的研究[18-20]结果表明circRNA在包括恶性肿瘤在内的各种疾病中具有重要作用，亦有研究[21]显示其与结直肠癌肝转移具有密切关联。circRNA在真核生物中高度富集，通常在不同发育阶段显示出组织特异性表达的序列保守性，基于多样性和组织特异性表达以及共价闭环结构的稳定性，这类分子可以作为生物标记物用于临床诊断和预后预测[22-25]。从功能上看，circRNA在转录后和基因表达调控中发挥重要作用，部分circRNA通过与miRNA竞争性结合干扰miRNA的功能，充当ceRNA阻止miRNA对靶向mRNA的翻译后抑制作用，进而调控靶基因的表达水平[26-27]。继miRNA和长链非编码RNA之后，circRNA成为肿瘤领域非编码RNA研究的新热点。ceRNA网络将circRNA、miRNA和miRNA下游靶向mRNA紧密相连，对由这些非编码RNA协同调控的网络开展深入研究将为结直肠癌诊断和治疗提供新策略。
本研究利用GEO数据鉴定结直肠癌患者无肝转移和肝转移组织间DEcircRNA、DEmiRNA和DEmRNA，并进行GO和KEGG富集分析，以帮助明确和证实结直肠癌肝转移相关的非编码RNA关键分子机制。基于circRNA构建了由14个节点组成的ceRNA网络，其中5个DEcircRNA（hsa circ 0062548, hsa circ 0000467, hsa circ 007372, hsa circ 0004071, hsa circ 0003180），5个DEmiRNA（hsa-miR-657, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-613, hsa-miR-1281, hsa-miR-3613-5p）和4个DEmRNA（HLA-DRA,TSPAN1,SLC28A2, MT1E），见图12。在构建的ceRNA网络中，已有文献报道hsa circ 0000467参与了胃癌进展，可作为胃癌诊断和判断预后的生物标记物[28-29]。近两年，hsa circ 0000467作为癌基因已被证明能够通过充当miRNA“分子海绵”，促进结直肠癌细胞增殖、转移和新生血管形成，参与结直肠癌进展[30-32]。值得一提的是，上述研究验证的miRNA并不是本研究中参与构成ceRNA网络的hsa-miR-548c-3p，这表明同一种circRNA下游可能存在多种受其调控的miRNA。有关hsa circ 0000467和has-miR-548c-3p如何参与结直肠癌转移的具体机制有待进一步深入研究。
本研究对DEmRNA做富集分析，结果显示所涉及通路和生物进程与免疫密切相关，通过分析免疫浸润分数发现结直肠癌无肝转移组患者的免疫浸润分数显著高于肝转移组，其ROC曲线证实了免疫浸润分数对判断结直肠癌肝转移的意义，表明构建的ceRNA网络可能是通过免疫机制调控肿瘤进程。通过对集中大分类免疫细胞进行评分，发现ceRNA网络中的DEmRNAHLA-DRA表达水平与免疫细胞浸润水平呈正相关，且其对应的ROC曲线显示以HLA-DRA预测结直肠癌肝转移具有较高的可信度与准确性。HLA-DRA是HLA Ⅱ类α链的一种，这种II类分子是一种锚定在膜中，由α链和β链组成的异二聚体。人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）又被称为人类主要组织相容性复合物，是一组编码细胞表面蛋白的基因，这些蛋白对免疫系统识别外来分子至关重要。HLA在6号染色体上有6种不同的HLA基因，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP，每一个都有巨大的等位基因多样性。研究结果表明[33]，与具有其他形式的HLA-A基因的人相比，HLA-A*03患者在免疫检查点抑制剂治疗后生存效果更差。2022年1月25日，FDA批准了一项首款T细胞受体治疗药物，用于治疗不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤的HLA-A*02：01阳性成年患者[34]。首个T细胞受体融合蛋白药物获批，是免疫疗法治疗实体瘤的里程碑式突破，表明HLA基因在肿瘤进展与免疫治疗方面存在相当大的潜在研究价值，这其中或许包括HLA-DRA基因。
本研究结果显示，与无肝转移组相比，结直肠癌肝转移组中未致敏CD4+T细胞表达水平升高，滤泡辅助性T细胞、活化的树突细胞和中性粒细胞表达水平降低，说明结直肠癌高肝转移性组织中免疫浸润水平相对较低。肿瘤在复杂的组织中依赖于这些环境来维持生长、侵袭和转移，这些组织环境中不仅包括肿瘤细胞本身，还有其周围的成纤维细胞、免疫和炎性细胞、胶质细胞等各种细胞，同时也包括附近区域内的细胞间质、微血管以及浸润在其中的生物分子，共同构成了肿瘤细胞生活的内环境，即肿瘤微环境[35]。比如，肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤微环境中的炎性浸润细胞，在肿瘤的进展和转移过程中发挥着重要作用，其特征在很大程度上取决于肿瘤微环境对其的刺激，同时肿瘤相关巨噬细胞也能参与形成抑制性髓系微环境和促瘤纤维微环境等[36-38]。为进一步了解肿瘤微环境概况，有研究对非小细胞肺癌组织样本以免疫细胞浸润程度进行亚型分型。结果表明在免疫细胞群比例方面，M0巨噬细胞、naive B细胞、以及活化的树突状细胞大量浸润的亚型，其个体的总生存期更好[39]。同样也有学者关注在乳腺癌中免疫细胞的免疫浸润水平，通过构建免疫预后评分模型以探索免疫浸润水平与乳腺癌预后的关系，研究[40]结果表明，该模型与乳腺癌患者生存时间、免疫基因组特征显著相关，可利用该模型针对性评估免疫微环境在化疗和免疫治疗策略中的重要性。在结直肠癌方面，近年来一种新的实体瘤全球转录组学免疫分类已经确定了6种免疫亚型，已有研究具体表征结直肠癌中的免疫亚型，并评估其与共识分子亚型的相互作用，通过相关性确定新的肿瘤微环境特征[41]。通过上述方法对患者进行更精确的分类，将对结直肠癌患者制定个体化治疗方案具有重要意义[41]。
图
12
环状RNA的ceRNA网络分析揭示HLA-DRA与结直肠癌肝转移及免疫浸润的相关性
Fig.
12
The ceRNA network analysis of circRNA reveals the correlation between HLA-DRA and colorectal cancer liver metastasis as well as immune infiltration
本研究基于circRNA构建ceRNA调控网络，聚焦ceRNA节点基因与肿瘤免疫微环境、免疫细胞浸润和肿瘤转移的相关性。研究发现，结直肠癌高肝转移组织中免疫细胞浸润水平低，ceRNA调控网络中的节点基因表达水平与免疫细胞浸润水平呈正相关，其中HLA-DRA基因正相关性最强。进一步分析表明，当HLA-DRA低表达时免疫细胞浸润呈低水平，结直肠癌肝转移性高、预后差，见图12。因此可在一定程度上以HLA-DRA表达水平预测结直肠癌肝转移及其患者预后，辅助临床诊断和治疗决策。基于circRNA的新型癌症治疗可能通过circRNA的功能丧失或功能获得[42]，且已有研究证实外源性circRNA在肿瘤疫苗中的巨大潜力[43]，因此，人工制备外源性circRNA使其过度表达实现其作为ceRNA功能的获得，进而使HLA-DRA正常表达并发挥其在肿瘤免疫环境中的作用或直接干扰致癌miRNA的表达，有望达到治疗目的。然而，将circRNA递送到细胞是临床实施的一大挑战，目前仍然缺乏临床试验的验证研究，且HLA-DRA在结直肠癌肝转移过程中表达下调，未来研究更应该关注其检测丰度和探索更高灵敏度的检测手段支持其临床治疗的指导价值。
本研究围绕ceRNA网络、免疫细胞浸润揭秘HLA-DRA基因与结直肠癌肝转移的相关性，为结直肠癌肝转移的早期诊断、免疫治疗和预后指标等方面提供理论基础。但本研究仍有不足之处，比如研究所应用的生物信息分析是基于公共数据库的分析方法，是用于预测疾病进展、药物治疗靶点的手段，有助于初步探索circRNA-ceRNA网络的作用机制，但目前本研究依托的数据库较少、样本量较小，且未在人结直肠癌细胞、临床组织标本和动物体内开展相关的验证和机制探索，因此对于HLA-DRA基因和ceRNA网络中其他节点基因是否与结直肠癌肝转移密切相关，其所涉及的机制以及作为结直肠癌生物标志物的可能性，后续研究应包括更大规模的患者队列、多中心数据集和系列功能实验进行更加全面、深入的验证。
4 结论
通过构建基于circRNA的ceRNA网络，揭示了结直肠癌肝转移中潜在的关键调控机制及免疫浸润相关性。该ceRNA网络包含差异表达的5个circRNA、5个miRNA和4个mRNA，与结直肠癌肝转移密切相关，功能富集分析表明，该网络中的mRNA主要参与白细胞活化调节和免疫反应通路，提示其在肿瘤免疫调控中的重要作用。免疫浸润分析显示，ceRNA调控网络中的节点基因表达水平与免疫浸润分数呈正相关，其中HLA-DRA基因正相关性最强。且TCGA数据库验证结果表明，HLA-DRA高表达时结直肠癌肝转移率较低，提示其可能作为预测结直肠癌肝转移的潜在生物标志物，有助于其临床诊断，并为治疗结直肠癌肝转移的分子靶向药物开发提供新思路。
