摘要
基于单细胞转录组数据和bulk转录组数据构建动脉粥样硬化诊断模型并预测其潜在治疗中药。本研究从GEO数据库中获取了GSE159677数据集，该数据集包含51981个细胞的单细胞转录组信息，涵盖了3个患者的动脉粥样硬化核心斑块及其匹配的颈动脉近端相邻组织，利用R软件limma包筛选差异基因。将差异基因与自噬相关基因取交集得到动脉粥样硬化自噬相关差异基因。利用R软件对差异基因进行GO和KEGG富集分析。收集了包含69个动脉粥样硬化样本和35个对照样本的转录组数据集（GSE100927），基于该数据集并利用LASSO进一步筛选关键差异基因并构建诊断模型。差异基因与自噬相关基因取交集得到25个基因。在此基础上，筛选出FOS、HIF1A、HSPA5、HSPA8、P4HB、RAB11A、RGS19、TNFSF10、VAMP 9个基因。基于这9个基因构建的诊断模型具有很好的预测能力，其曲线下面积（Area under curve, AUC）为0.99（95% CI：0.976~1.0）。此外，对9个核心基因进行靶向中药预测，共筛选出182味潜在中药。该研究成果为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供了新思路。
Abstract
The purpose of study is to construct a diagnostic model for atherosclerosis and predict its potential therapeutic Traditional Chinese Medicine based on single-cell and bulk transcriptomic data. his study utilized the GSE159677 dataset from the GEO database, containing single-cell transcriptomic profiles of 51,981 cells from atherosclerotic core plaques and matched proximal adjacent carotid tissues of three patients. Differential gene expression analysis was performed using the limma package in R. The intersection of DEGs and autophagy-related genes was used to obtain atherosclerosis-related autophagy-associated DEGs. GO and KEGG enrichment analyses were performed on the DEGs using R software. Based on the transcriptomic data from GSE100927 dataset, which includes 69 atherosclerosis samples and 35 controls, comprising 69 atherosclerosis samples and 35 controls was analyzed, LASSO regression was used to further select key DEGs and construct a diagnostic model. The intersection of DEGs and autophagy-related genes resulted in 25 genes. From this, FOS, HIF1A, HSPA5, HSPA8, P4HB, RAB11A, RGS19, TNFSF10, and VAMP were selected. The diagnostic model based on these 9 genes demonstrated excellent predictive performance, achieving an area under the curve (AUC) of 0.99 (95% CI: 0.976–1.0). Additionally, 182 potential traditional Chinese medicine (TCM) candidates targeting these core genes were predicted. In conclusion, the results of this study provide novel insights into the diagnosis and treatment of atherosclerosis.
动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种与脂质代谢障碍有关的全身性疾病，其病变特点是血液中的脂质进入动脉管壁并沉积于内膜形成粥样斑块，导致血管壁变硬，弹性减弱，血管腔变窄[1]。随着时间的推移，动脉粥样硬化斑块变得更加纤维化，并积累钙等矿物质。晚期动脉粥样硬化斑块会侵入动脉管腔，阻碍血流并导致组织缺血。中风、心肌梗死、外周动脉疾病和缺血性心脏病都是由动脉粥样硬化引起的。心血管疾病是世界范围内导致死亡的主要原因，动脉粥样硬化是其发病的主要因素[2]。到2020年，全球有20亿人有颈动脉粥样硬化，其中33%以上在中国[3]，严重影响着国人的健康。自噬是一种依赖溶酶体的细胞自我保护的分解代谢途径。在真核细胞中起维持细胞内稳态的作用[4]。有研究报道，细胞自噬与动脉粥样硬化有关，自噬可通过抑制炎症和抵抗细胞凋亡等影响动脉粥样硬化的发生和发展[5-6]。
Mao等[7]的研究中发现，Piezo1可通过促进YAP激活和核易位来调节内皮细胞自噬，从而促进动脉粥样硬化的进展。凋亡的内皮细胞是促凝剂，可增强血小板黏附，促进斑块破裂后血栓的形成。Hu等[8]研究发现，HIF-1α是动脉粥样硬化与正常状态之间上调的显著差异基因，共同调节自噬和铁死亡。HIF-1α抑制剂PX-478通过增强巨噬细胞中的自噬和抑制铁死亡来减轻泡沫细胞形成和动脉粥样硬化。在动脉粥样硬化的早期病变中，脂质代谢紊乱和巨噬细胞向泡沫细胞的转化起着关键作用。相关研究表明，丹参多酚酸可通过激活细胞自噬通路，改善由ox-LDL引起RAW264.7细胞的脂质积累，抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化，减轻AS早期病变[9]。多项研究证实了自噬在动脉粥样硬化中发挥着重要的作用，然而对自噬相关基因用于动脉粥样硬化的风险预测的研究相对较少。
在中医理论中，动脉粥样硬化被理解为一种“本虚标实”的病理状态。“本虚”指的是机体基本功能的不足，具体表现为气虚、阳虚或阴虚；而“标实”则是指病理产物的积聚，包括血瘀、痰浊、气滞和寒凝。针对这一病理特点，中医在防治动脉粥样硬化时，主要采用单味药物和复方成药进行治疗，其治疗策略着重于活血化瘀、祛痰降脂以及扶正补虚[10]。目前研究表明，众多中药来源的天然活性化合物在动脉粥样硬化治疗中发挥的作用逐渐得到肯定，干预血管自噬成为众多中药来源化合物作用的靶标。
近年来，随着基因组学和高通量测序技术的快速发展，基因水平的研究为揭示动脉粥样硬化（AS）的复杂机制提供了新的视角。越来越多的研究表明动脉粥样硬化的发生与发展涉及多个基因的异常表达和调控，这些基因参与了脂质代谢、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和自噬等关键生物学过程。Su等[11]的研究发现，胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP6）的表达水平在动脉粥样硬化斑块患者血清中显著降低，且证实IGFBP6可能通过调节内皮细胞炎症和维持血管稳态，减轻动脉粥样硬化的发展。此外，研究表明，转录因子EB（TFEB）的上调可减少血管内皮细胞中的氧化应激程度以及白细胞向内皮细胞的募集，从而预防动脉粥样硬化（AS）的发展[12]。这些研究不仅揭示了基因表达在动脉粥样硬化中的重要作用，还为基于基因表达的动脉粥样硬化风险预测模型的构建提供了理论基础。
本研究通过生物信息学方法，基于单细胞转录组测序（Single cell transcriptome sequencing，scRNA-seq）和bulk转录组测序（Bulk transcriptome sequencing，bulk RNA-seq）数据集探讨AS相关自噬基因作为其诊断生物标志物的临床价值，并预测靶向自噬相关基因的中药，旨在为动脉粥样硬化临床诊断和治疗提供新的思考。
1 材料与方法
1.1 数据来源
从GEO数据库（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载表达数据集（GSE159677、 GSE100927和GSE43292）。GSE159677为单细胞转录组数据，包含3个粥动脉硬化样本和3个正常对照组织样本，GSE100927为bulk转录组数据，含29例粥动脉硬化患者样本和12例对照样本，作为训练集。GSE43292数据集包含32例粥动脉硬化患者样本和32例对照样本，作为验证集。从人类自噬数据库（Human autophagy data-base，HADb）下载共232个自噬相关基因（Autophagy-related gene，ATGs）。
1.2 单细胞数据分析
使用 R中的“Seurat”包[13]（版本4.1.1）对单细胞测序数据进行处理，通过CreateSeuratObject 创建矩阵对象，剔除具有超过20%的线粒体基因的细胞。为了可视化和统计分析scRNA-seq数据集，使用聚类分辨率为0.5的FindNeighbors和FindClusters 函数进行细胞簇聚类分析[14]，然后使用“clustertree”R包[15]（版本0.5.1）进行识别和可视化。
1.3 自噬差异的筛选和分析
首先对数据集进行标准化和归一化处理后，随后使用“limma” R包[16]（版本3.44.3）分析动脉粥样硬化和对照样本之间的差异基因。以差异表达倍数的绝对值大于 1，且校正后的P值小于0.05为标准筛选差异基因。将差异基因与人类疾病相关的自噬基因取交集获得自噬差异基因。分别通过“VennDiagram”[17]（版本1.7.3）和〗“Ggplot2”[18]（版本3.3.2）绘制韦恩图和火山图。
1.4 功能富集分析
基于MSigDB 数据库，利用R中的“clusterProfiler”包[19]（版本3.16.1）来分析动脉粥样硬化差异自噬相关基因进行基因本体论（Gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，P＜0.05 被认为具有显著性，利用“ggplot2”包[18]（版本3.3.2）实现可视化。
1.5 诊断模型的建立与评估
采用最小绝对收缩选择算子（LASSO）回归方法筛选动脉粥样硬化诊断中关键基因，使用“glmnet”R包[20]（版本4.1-3）来建立预后模型。使用R软件中的“pROC”[21]（版本1.16.1）包绘制受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线图，评估已确定的生物标志物的诊断价值。使用R 软件中的“rms”包[22]（版本6.8-1）建立列线图进行综合风险分值评估。另外，在验证数据集GSE43292中进一步验证模型的诊断效能。
1.6 中药预测分析
Coremine Medical（http: //www.coremine.com/medical）是一个综合性生物医学数据库，整合了来自多个权威数据源的生物医学信息，能够通过基因-药物关联网络预测潜在的中药成分及其作用靶点。应用Coremine Medical数据库，将筛选的到9个基因与具有潜在治疗作用的中药进行映射，根据数据库中提供的基因与中药之间的相关性P值进行筛选，选取其中P＜0.05的中药予以汇总分析。
2 结果
2.1 动脉粥样硬化单细胞图谱及差异基因分析
本研究分析了来自GSE159677数据集的动脉粥样硬化及对照样本的单细胞测序数据，首先通过质量控制排除低质量线粒体细胞后，选择51 721个细胞用于后续分析。基于过滤后的单细胞数据，使用统一流形逼近与投影（Uniform manifold approximation and projection，UMAP）算法对细胞进行聚类，最终得到22个细胞簇，进一步通过分析将22个细胞簇分为 13种细胞类型（图1）。
图1动脉粥样硬化和正常对照样本细胞群的聚类及注释
Fig.1Clustering and annotation of cell populations in atherosclerosis and normal samples
2.2 动脉粥样硬化自噬差异基因分析
为了鉴定动脉粥样硬化组与正常组之间在单细胞水平上的差异表达基因，我们以平均log2倍数变化（Avg log2FC＞1）且校正后的P值（Padj≤0.05）为阈值，进行了差异基因筛选。结果共得到101个DEGs，其中上调基因28个，下调基因73个，显著差异基因的火山图（图2（a））。从人类自噬数据库获得共232个自噬相关基因，将其与差异基因进行韦恩图分析，最终得到25个动脉粥样硬化自噬差异基因（图（2b））。
图2动脉粥样硬化相关自噬基因分析
Fig.2Analysis of autophagy-related genes in atherosclerosis
注：（a）差异基因火山图；（b）差异基因与自噬基因韦恩图.
2.3 功能富集分析
接下来，对自噬差异基因进行富集分析。GO分析显示，动脉粥样硬化自噬相关基因主要富集在细胞凋亡信号通路（Apoptotic signaling pathway）、RNA转录正调控（Positive regulation of transcription from RNA）、内质网中的蛋白质折叠（Protein folding in endoplasmic reticulum）等生物学过程。主要定位于内质网分子伴侣复合体（Endoplasmic reticulum chaperone complex）、细胞-基质连接（Cell-substrate junction）、黏着斑（Focal adhesion）、包被小泡（Coated vesicle）等。主要参与热休克蛋白结合（Heat shock protein binding）、错误折叠蛋白结合（Misfolded protein binding）、泛素蛋白连接酶结合（Ubiquitin protein ligase binding）等分子功能（图3（a））。
KEGG分析结果显示，动脉粥样硬化自噬相关基因主要富集在脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、内质网中的蛋白质加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、抗原处理与呈递（Antigen processing and presentation）、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）等信号通路（图3（b））。
2.4 动脉粥样硬化中自噬相关诊断特征生物标志物的识别
为了进一步识别可用于预测动脉粥样硬化的诊断的关键标志物，从GEO 数据库下载动脉粥样硬化（GSE100927）的基因表达谱。对上述得到的25个动脉粥样硬化自噬差异基因进一步分析，采用 LASSO 回归最终共筛选9个关键基因：FOS、HIF1A、HSPA5、HSPA8、P4HB、RAB11A、RGS19、TNFSF10、VAMP（图4）。
2.5 诊断模型的构建与验证
基于筛选到的9个关键基因构建诊断模型，并利用受试者工作特征曲线对模型的预测能力进行评价。结果显示AUC为 0.99（95% CI：0.976~1.0）（图5（b）），说明该模型在训练集具有较好的预测能力。另外，通过构建了诊断标志物的列线图模型来预测动脉粥样硬化的发病风险，结果显示该模型具有很好的预测价值（图5（a））。接下来，使用外部数据集（GSE43292）对上述模型效能进行验证，结果显示其AUC为0.81（95% CI:0.706~0.917），表明其具有可靠的诊断价值（图5（c））。
2.6 动脉粥样硬化自噬相关核心基因潜在中药预测
利用Coremine Medical在线数据库，将9个核心基因与具有潜在治疗作用的中药进行映射，以P＜0.05筛选潜在的靶向中药（表1）。共筛选出182味中药。FOS匹配到栀子、人参、猴头菌等19味中药。HIF1A匹配到人参、龙胆草、川芎、黄岑、茯苓、三七等41味中药。HSPA5匹配到天麻、穿心莲、车前草、丹参等66味中药。P4HB匹配到杜仲、当归、菟丝子等9味中药。TNFSF10匹配到白首乌、金钱草、雷公藤等25味中药。HSPA8匹配到连翘、益母草、黄芪等22味中药。RAB11A、RGS19、VAMP未匹配到中药。
图3动脉粥样硬化中自噬相关基因的 GO 与 KEGG 富集分析
Fig.3GO and KEGG enrichment analysis of autophagy-related genes in AS
注：（a）GO;（b）KEGG.
图4LASSO 回归分析
Fig.4Analysis results of LASSO regression
图5诊断模型构建和验证
Fig.5Construction and validation of the diagnostic model
注：（a）基于9种基因的列线图模型；（b）GSE100927中9种标志物模型的受试者工作特征曲线;（c）验证集GSE43292 中诊断模型的受试者工作特征曲线.
表1基因靶向代表中药
Table1Representative traditional Chinese medicines
3 讨论
动脉粥样硬化是一种慢性，进展性的血管疾病，近年来其发病率和患病率逐渐上升，给我国的医疗系统带来了巨大的负担和挑战。本研究通过结合scRNA-seq和RNA-seq数据集并使用系统的生物信息学工具，综合分析了动脉粥样硬化相关自噬差异基因，构建了动脉粥样硬化的风险预测模型并且进行了相关靶向中药预测，为动脉粥样硬化的临床诊断和治疗提供了新的思考。
本研究基于scRNA-seq数据筛选动脉粥样硬化与正常对照的差异表达基因，并通过与自噬相关基因集去交集，最终得到25个动脉粥样硬化相关的自噬基因。基于bulk RNA-seq数据，通过LASSO 回归最终得出9个基因（FOS、HIF1A、HSPA5、HSPA8、P4HB、RAB11A、RGS19、TNFSF10、VAMP）构建的风险模型可很好的预测动脉粥样硬化。其中，低氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF1A）是一种对低氧环境响应的关键转录因子，其参与调控血管生成、能量代谢和细胞存活[23]。研究表明，HIF1A与动脉粥样硬化斑块的进展有关，随着成熟斑块的生长，会导致它们突入血管中，这将减少血液循环，并可能导致细胞无法获得所需的氧气或营养物质[24]。也有研究证实HIF1A与动脉粥样硬化的风险的相关性其表达水平随的风险增加而升高[25]。由此证明，HIF1A不仅是动脉粥样硬化潜在的关键基因，还可能作为动脉粥样硬化潜在的治疗的靶点，通过调节其表达或活性来抑制斑块进展。FOS已被报道与多种疾病有关，Wang等[26]研究结果发现FOS和相关基因或蛋白质可以超越传统的临床标志物，并可能用作静脉血栓栓塞的诊断生物标志物。FOS作为一个关键的转录因子，在调控动脉粥样硬化相关的基因表达和细胞反应中发挥作用[27]。未来研究可进一步探索其在动脉粥样硬化中的具体作用机制，并评估其作为生物标志物或治疗靶点的潜力。热休克蛋白家族A成员5（HSPA5）和SPA5热休克蛋白家族A成员8（HSPA8），是一种内质网分子伴侣蛋白，其在内质网（ER）应激反应和未折叠蛋白应答（UPR）中起着关键作用，这两者对于细胞内蛋白质折叠、组装和质量控制至关重要[28]。Zhao等[29]研究结果显示，HSPA8发生基因突变与颈动脉粥样硬化有关，可作为预测心血管疾病的分子标志物。这与本文研究结果一致，提示HSPA5和HSPA8在动脉粥样硬化中具有重要的生物学意义，提示其可作为改善蛋白质稳态的治疗靶点，通过药物干预其分子伴侣活性可能延缓动脉粥样硬化进展，未来可通过体外和体内实验进一步验证其作为治疗靶点的潜力。P4HB基因（Prolyl4-hydroxylase，beta polypeptide）编码一种内质网分子伴侣蛋白，具有氧化还原酶、分子伴侣和异构酶的活性，它在多种疾病中发挥重要作用。研究表明，P4HB可能通过调节氧化应激和炎症反应，影响心血管疾病的发生和发展[30]。这表明PH4B在动脉粥样硬化中的重要价值，并可作为动脉粥样硬化潜在的治疗靶点。此外，其多效性功能为开发兼具抗氧化和抗炎效应的多靶点药物提供了理论依据，结合其异构酶活性设计小分子抑制剂可能成为治疗新策略。肿瘤坏死因子超家族成员10（TNFSF10）作为一种细胞因子，参与调节动脉粥样硬化中的炎症过程。NFSF10还可通过与其他细胞因子和受体的相互作用，影响血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡，参与动脉粥样硬化斑块的形成和进展[31]。同样证明其在动脉粥样硬化中的重要价值。
功能富集分析结果显示，动脉粥样硬化自噬相关基因主要富集内质网蛋白、热休克蛋白等分子功能，以及富集内质网加工、脂质与动脉粥样硬化等信号通路。越来越多的证据表明，在动脉粥样硬化病变的病理条件下，氧化应激，脂质和胆固醇的超负荷等刺激因素，均可引起内质网的紊乱，进而诱导新的内质网应激（ERS）。持续性存在的内质网应激状态会进一步诱导细胞凋亡及炎症，从而促进了动脉粥样硬化的发生与发展[32]。贾等[33]的研究证实了内质网应激信号通路蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）参与动脉粥样硬化斑块发生发展。热休克蛋白（HSPs）是促进蛋白质折叠和转运的伴侣蛋白，在维持细胞稳态和存活中起着重要作用[34]。近年来研究表明热休克蛋白与动脉粥样硬化有密切联系。一些热休克蛋白可通过诱导自身免疫，增强炎症反应，促进血管平滑肌细胞增殖，迁移，促进动脉粥样硬化的发生发展[35]。也有研究发现热休克蛋白可以作为损伤相关分子模式，激活免疫系统，但过度的免疫反应也可能导致动脉粥样硬化的发展[36]。这些结果表明了研究分析得到的自噬相关基因在动脉粥样硬化中参与调控动脉粥样硬化的发生发展，具有重要的作用。
动脉粥样硬化中医属于正气愈虚，体内细胞自噬不足，免疫力低下，亦易感邪气。内外合邪为患，邪气入脉络耗伤正气，正邪失调，其无法降解自身痰浊、瘀血、湿毒等病理产物积聚体内无法清除。为此，本研究对动脉粥样硬化相关自噬基因进行潜在靶向预测的中药主要为人参、丹参、当归、川芎、三七、黄芪等。有研究结果发现，黄芪中的代表性活性单体成分黄芪甲苷具有上调内皮细胞中自噬相关蛋白，从而诱导内皮细胞自噬，起到内皮保护作用及抗炎作用[37]。中医认为动脉粥样硬化应以“扶正”治疗，即当以补益精气血津液为主。而人参具有补气血的作用，且有研究证实其提取物人参皂苷化合物K具有诱导上调自噬，延缓动脉斑块的形成及抗炎的作用[38]。另外，Wu等[39]的研究表明，人参皂苷Rb1能够通过激活AMPK信号通路来增强巨噬细胞的自噬能力，进而促进动脉粥样硬化中脂质斑块的代谢。中药丹参中提取的丹参酮IIA可以通过调节自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin-1的表达，并通过增强AMPK信号通路以及抑制mTOR信号通路来促进内皮细胞自噬的增加，从而有助于改善血管功能[40]。另外一项研究[41]中发现，丹参组成部分SAB可显著抑制肿瘤坏死因子诱导的黏附分子、细胞因子和趋化因子表达，发挥抗炎、抗动脉粥样硬化活性。当归为“血中圣药”，其抗动脉粥样硬化的作用主要是通过改善血液流变性，保护和修复血管内皮细胞，抗炎等作用实现的。研究发现当归及其活性成分对于抗动脉粥样硬化具有确切的作用，其中当归中部分有机酸和挥发油成分可通过PPARG、MTTP靶标作用炎症及脂质代谢通路对抗动脉粥样硬化的发生[42]。益气活血药组人参三七川芎同样具有扶正祛邪的作用，其提取物可促进内皮细胞自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-II上调，从而调节自噬延缓内皮细胞衰老，起到治疗和预防动脉粥样硬化的作用[43]。本研究通过靶向预测筛选出治疗动脉粥样硬化的潜在有效中药，为中药现代化研究提供了重要线索。然而，鉴于临床实践中多采用中药复方而非单一中药，未来研究将结合网络药理学和多组学技术，深入探索这些潜在靶向中药之间的配伍关系，并构建中药复方，以进一步挖掘其临床应用价值，为动脉粥样硬化的中医治疗提供更具科学性和实用性的策略。
综上所述，（1）本研究利用生物信息学技术，整合单细胞和bulk转录组数据，筛选出与自噬相关的动脉粥样硬化诊断标志物，构建了动脉粥样硬化诊断模型；（2）本研究中筛选到一些关键基因包括HIF1A和FOS等，可能通过调控自噬、炎症反应和氧化应激等途径参与动脉粥样硬化的进展，为深入理解其分子机制提供了新的视角；（3）基于关键基因，本研究预测了182味潜在的中药，为动脉粥样硬化的靶向药物开发和精准治疗提供了新的候选药物和研究方向。本研究仍存在一些局限性。首先，该研究是基于公共数据库中数据构建的，这些数据在样本来源、异质性和数据质量方面可能存在一定的局限性。其次，尽管成功构建了动脉粥样硬化的诊断模型，但尚未通过体外或体内实验对其潜在的分子机制进行验证。
