摘要
为预测Sestrin1蛋白的结构与功能，应用生物信息学方法对该蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、蛋白质相互作用和功能进行分析。结果显示，Sestrin1是一种不稳定的胞内亲水蛋白，无信号肽和跨膜区域，可发生磷酸化修饰。其二级结构以α-螺旋为主，SESN-A和SESN-C为主要功能结构域，通过残基Cys130、Asp418和Asp419发挥抗氧化作用。本研究为进一步探讨Sestrin1蛋白在高原红细胞增多症发生发展中的作用机制提供理论依据。
Abstract
To predict the structure and function of the Sestrin1 protein, bioinformatics methods are used to analyze its physicochemical properties, secondary structure, tertiary structure, protein interactions and functions. The results show that Sestrin1 is an unstable intracellular hydrophilic protein, lacking signal peptides and transmembrane regions, and can undergo phosphorylation modification. Its secondary structure is predominantly α-helical, with SESN-A and SESN-C as the main functional domains. It exerts antioxidant effects through the residues Cys130, Asp418 and Asp419. This study provides a theoretical basis for further exploring the role of the Sestrin1 protein in the development of high-altitude polycythemia.
高原红细胞增多症（High altitude polycythemia，HAPC）是高原低氧胁迫致机体红细胞过度积累，严重低氧血症的慢性高原病，易并发心脑血管意外等多种高致死率疾病，严重威胁高原人群的身心健康[1]。据统计，全世界约有1.4亿人居住在高海拔地区[2]。故开展HAPC的防治研究具有重要的现实意义。
活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是线粒体产生的一组性能活跃的反应性氧种类，其含量受到氧化/抗氧化系统的调节。生理水平的ROS可充当反应通路信号；超负荷的ROS会造成线粒体及其他细胞器的损伤，影响细胞结构及功能的完整性，是导致多种急、慢性疾病发生的重要缘由[3-5]。研究表明，超负荷的ROS参与HAPC的发生发展过程[3]。高原低氧可诱发ROS过量生成，增强促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）的表达[4-5]，过量EPO与骨髓EPO受体结合后，激活下游JAK2-STAT5，PI3K-AKT等途径，致使红细胞过度积累[6-7]。可见，抗氧化是防治HAPC的重要环节。
Sestrins是一组高度保守的应激诱导性代谢调节因子，同系物为Sestrin1、Sestrin2和Sestrin3，它们的氨基酸序列相似性接近50%[8]。Sestrins通过激活AMPK、抑制mTOR、激活自噬、抗正常细胞凋亡等途径提供细胞保护作用[9-10]。X射线晶体学分析明确Sestrin2包含三个功能结构域：SESN-A、SESN-B和SESN-C[11]。SESN-A的氧化还原活性位点发挥抗氧化功能；SESN-B是螺旋-环-螺旋结构，连接着SESN-A和SESN-C；SESN-C借助自身的GATOR2作用位点和亮氨酸结合位点，减弱mTORC1信号传导功能，间接抑制ROS生成[11-17]。近年来，Sestrin1蛋白在低氧等相关疾病中的调节功能逐渐受到人们的关注。功能学实验表明，癌细胞中Sestrin1蛋白表达的增强或抑制，显著影响细胞增殖等生理功能。Sestrin1亦可通过Keap1-Nrf2抑制mTORC1等通路发挥抗氧化功能[18-21]。但是，其空间构象及相互作用蛋白仍不清楚。
生物信息学通过已知序列和结构数据建立模型算法，同时充分利用序列与结构的相关性，为未知蛋白质结构预测和理解蛋白质功能及相互作用提供了强有力的理论支撑和技术保障。生物信息学方法具有高效处理和分析海量生物数据，节约时间、资金等资源成本的优势。故本研究通过类比Sestrin2，应用生物信息学方法对Sestrin1的蛋白序列、理化性质、二级结构、三级结构、蛋白质相互作用、KEGG/GO功能和通路富集等进行预测和分析，为进一步研究Sestrin1的功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从NCBI网站获取Sestrin1（NP_001013388.2）和Sestrin2（NP_113647.1）的蛋白序列信息。Sestrin1由492个氨基酸残基组成，其编码基因位于染色体10B2，mRNA 转录本位于Chr10：41686570-41784432区域。Sestrin2由480个氨基酸残基组成，其编码基因位于染色体1p35.3，mRNA 转录本位于chr1:28、259、518-28、282、491区域。
1.2 方法
运用现有生物数据库及软件依次对Sestrin1的理化性质、空间结构和蛋白质相互作用进行分析和预测，各数据库及分析软件信息详见表1。
表1分析Sestrin1的软件及数据库
Table1Software and databases used for the analysis of the Sestrin1
2 结果
2.1 Sestrin1的理化性质分析
利用Expasy-ProtParam分析Sestrin1的理化性质，结果见表2。
2.2 Sestrin1的亲疏水性分析
Expasy-ProtScale分析显示（图1），Sestrin1第203位缬氨酸疏水性最强，分值为2.433，第291位谷氨酸亲水性最强，分值为-2.722。总平均亲水性为-0.350，Sestrin1整体呈现亲水性，提示其属于亲水性蛋白。
表2Sestrin1的理化性质分析
Table2Physicochemical properties analysis of the Sestrin 1
图1Sestrin1的亲疏水性分析
Fig.1Hydrophobicity and hydrophilicity analysis of the sestrin1
2.3 Sestrin 1的潜在信号肽剪切位点、跨膜结构域和亚细胞定位分析
SignalP 5.0 Server分析显示（图2（a）），Sestrin1拥有信号肽的概率为0.008 7，未显示剪切位点，表明该蛋白没有信号肽；TMHMM Server 2.0分析显示（图2（b）），Sestrin1蛋白跨膜结构域的数量为0，表明该蛋白不存在跨膜结构；PSORT II分析显示，该蛋白位于细胞质、细胞外、细胞核、线粒体、内质网、细胞骨架的概率分别为43.5%、17.4%、17.4%、13.0%、4.3%、4.3%，提示该蛋白主要在细胞质内发挥生物学功能。综上所述，推测该蛋白可能是一种胞浆蛋白。
2.4 Sestrin1磷酸化修饰分析
Netphos 3.1 Server预测显示（图3），Sestrin1存在47个潜在的磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有29个，苏氨酸磷酸化位点有8个，酪氨酸磷酸化位点有10个。
图2Sestrin1的信号肽剪切位点和跨膜结构域预测
Fig.2Predicted signal peptide cleavage sites and transmembrane domains of Sestrin1
注：（a）信号肽剪切位点预测；（b）跨膜结构域预测.
图3Sestrin1的磷酸化位点预测
Fig.3Predicted phosphorylation sites of the Sestrin1
2.5 Sestrin1与Sestrin2序列比对分析
NCBI blast分析显示，Sestrin1和Sestrin2的序列相似性高达59.62%。为进一步明确Sestrin1结构域的氨基酸序列，采用MEGA11.0软件进行预测。MEGA11.0是集成多种经典序列比对算法，支持序列比对、系统发育树构建、进化模型选择、进化参数估计等多功能的分析软件，其核心算法ClustalW能够很好地识别保守区域，采用渐进式比对方法可有效比对蛋白之间的同源性。结果显示，Sestrin 1的Phe71-Gly249（F71-G249）与Sestrin2 SESN-A的氨基酸序列，即Gly66-Ser239（G66-S239）同源性较高（图4（a））。Sestrin 1的Thr320-Thr492（T320-T492）与Sestrin2 SESN-C的序列，即Pro308-Thr480（P308-T480）高度保守（图4（b））。由此推测Sestrin 1可能存在SESN-A和SESN-C结构域，SESN-A可能位于Phe71-Gly249（F71-G249），SESN-C可能位于Thr320-Thr492（T320-T492）。利用Blast分别比对这两个结构域氨基酸序列的相似度，发现Sestrin1与Sestrin2的SESN-A的氨基酸序列相似度为59.39%，SESN-C结构域的氨基酸序列相似度高达73.41%。
图4Sestrin1与Sestrin2序列比对
Fig.4Sequence alignment between Sestrin1 and Sestrin2
注：（a）Sestrin2 Sesn-A与Sestrin1的Phe71-Gly249（F71-G249）序列比对；（b）Sestrin2 Sesn-C与Sestrin1的Thr320-Thr492（T320-T492）序列比对.
2.6 Sestrin1二级结构预测
SOPMA分析显示（图5），Sestrin1蛋白中α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-sheet）、β-转角（β-turn）、无规则卷曲（Random coil）占比分别为55.08%、6.10%、3.25%、35.57%。与Sestrin2的二级结构进行对较，发现Sestrin1和Sestrin2的二级结构基本相似，主要以α-螺旋为主。
图5Sestrin1的二级结构预测
Fig.5Secondary structure prediction of the Sestrin1
2.7 Sestrin1三级结构预测
tFold先通过“多数据来源融合”技术挖掘多组多序列联配中的共进化信息，再借助“深度交叉注意力残差网络”提高蛋白2D结构信息的预测精度，最后通过“模板辅助自由建模”方法，将自由建模和模板建模生成的蛋白3D模型中的结构信息有效融合，这种“从头折叠”的运行模式可大幅提升蛋白结构预测的精度。故采用tFold对Sestrin1的三级结构进行预测。如图6（a）所示，Sestrin1蛋白主要以α-螺旋为主。该模型评分0.90，评分范围在0~1，越接近1，该模型的质量越高。通过在线软件Structural analysis and verification server对Sestrin 1蛋白进行拉式图谱分析，评估该模型Cα角度合理性，得到的结果如图6（b）所示，最佳接受区域（红色）的氨基酸残基数占比90.6%，接受区域（黄色）氨基酸残基数占比8.5%，最大接受区域（浅黄色）氨基酸残基数占比0.4%，不允许区域（白色）氨基酸残基数占比0.4%，由此可知，该蛋白模型99.6%的氨基酸残基数位于可接受区域，即该模型Cα角度合理性较高。综上所述，该蛋白模型质量极高。在PyMol中比对Sestrin 1与Sestrin 2的三级结构[23]，并通过均方根距离（RMSD）说明两者的结构相似性。均方根距离最常用于表示分子两个构象之间结构相似性，RMSD值越小，结构的相似性越高[24-25]。结果如图6（c）所示，RMSD值为0.408，二者的空间构象高度相似。同时，分别比对SESN-A和SESN-C，发现SESN-A的RMSD值为0.433，SESN-C的RMSD值为0.408，提示Sestrin 1与Sestrin 2的SESN-A和SESN-C的结构极其相似。
基于上述预测的结构基础，根据Sestrin 2发挥功能的关键位点，即C125、D406、D407，匹配到Sestrin1可能发挥功能的关键位点（图6（d）），为C130、D418、D419。
图6Sestrin1的三级结构预测
Fig.6Tertiary structure prediction of Sestrin1
注：（a）Sestrin1的三级预测结构；（b）Sestrin1的拉式图谱分析；（c）Sestrin1与Sestrin2三级结构比对，绿色为Sestrin1，红色为Sestrin2；（d）Sestrin1关键位点展示.（彩图见电子版）.
2.8 Sestrin1互作蛋白预测及其功能和通路富集分析
通过String数据库，对Sestrin1进行分析并构建蛋白互作网络图，设置为高置信度，按照置信度从高到低选取了10个蛋白，结果如图7（a）所示，Sestrin1主要与WDR24、SEH1L等蛋白相互作用。基于Sestrin2与互作蛋白WDR24、SEH1L的结合位点，利用AlphaFold3预测出Sestrin1通过L363、D358、D376、D418、D419与WDR24结合；与SEH1L结合的保守位点为S195，如图7（b），7（c）所示。基于Metascape数据库，GO分析结果表明，Sestrin1的生物学功能与自噬密切相关，KEGG分析显示，该蛋白主要富集于mTOR signal pathway（图7（d））。
3 讨论
本研究运用生物信息学方法对Sestrin1的结构与功能展开了预测分析。回溯至2015年，Sestrin2 的晶体结构已被成功解析，这为后续研究奠定了重要基础。在此背景下，我们对Sestrin1和Sestrin2 的蛋白序列进行了深入比对，结果显示二者的同源性高达59.62%。这一高同源性结果提示，Sestrin1 极有可能包含SESN-A和SESN-C功能结构域，并很可能借助它们来发挥抗氧化功能。
图7Sestrin1蛋白质相互作用及功能和通路富集分析
Fig.7Analysis of protein-protein interactions, functions and pathway enrichment of Sestrin1
注：（a）Sestrin1的蛋白互作网络预测；（b）Sestrin1与WDR24结合位点展示，绿色为Sestrin1，蓝色为WDR24；（c）Sestrin1与SEH1L结合位点展示，绿色为Sestrin1，蓝色为SEH1L；（d）Sestrin1的功能和通路富集分析.（彩图见电子版）.
肽类的抗氧化活性与其氨基酸组成密切相关。研究表明，亮氨酸、半胱氨酸等具有较好的抗氧化活性[22-26]。分析Sestrin1的氨基酸组成发现亮氨酸占10.0%（含量最高），半胱氨酸含量占2.2%，提示这两种氨基酸可能参与执行Sestrin1的抗氧化活性。进一步的理化性质分析显示，Sestrin1为不稳定的胞内亲水蛋白、无信号肽和跨膜区域，可发生磷酸化修饰，这提示Sestrin1不直接参与亚细胞器的迁移、黏附及囊泡运输，属于胞浆内可诱导蛋白；Sestrin1表面可能通过氢键与水分子结合以稳定其空间构象，从而确保正常功能的发挥；Sestrin1的潜在磷酸化位点可能会影响其与亮氨酸的结合能力，进而改变对mTORC1调控的活性[27]。
底物特异性研究表明，AhpD是广谱特异性的烷基氢过氧化物酶。活性位点突变实验证明AhpD的CXXC基序中Cys129、Cys132是发挥抗氧化功能的关键位点[28]。有研究发现Sestrin2 SESN-A结构域的Ser109-Thr139（S109-T139）肽段与AhpD的CXXC基序具有较高的相似性[11]。体外实验证明，SESN-A具有烷基氢过氧化物还原酶的作用，其中Cys125是烷基氢过氧化物还原过程中被氧化的主要催化残基[11]。在本研究中，通过比对分析Sestrin1和Sestrin2的序列和结构，结果显示Sestrin1 SESN-A结构域的Leu114-Val144（L114-V144）肽段与Sestrin2的S109-T139具有高度同源性，Sestrin1的Cys130类似于Sestrin2的Cys125，可能直接发挥抗氧化功能。
Sestrin2通过调节GATOR1-GATOR2蛋白复合物来抑制mTORC1活性，间接发挥抗氧化作用[29-30]。GATOR1对Rag GTPases具有GTP酶激活蛋白（GAP）活性，GATOR2是由WDR24、MIOS、WDR59、SEH1L和SEC13亚基构成的异源五聚体[31]。据报道，Sestrin2可通过与GATOR2结合，释放GATOR1并触发GATOR1对Rag GTPases的GAP活性，抑制mTORC1的活化，一方面减少ROS产生，另一方面激活ULK1启动线粒体自噬，消除受损细胞器[32-35]，最终达到抗氧化目的。Kim等[11]分析Sestrin2的空间构象，发现Sestrin2 SESN-C肽段中的Pro308-Thr480（P308-T480）能够抑制mTORC1活性，其中DD基序（D406，D407）是其关键功能位点。本研究应用MEGA11.0进行序列比对，发现Sestrin1的SESN-C肽段，即Thr320-Thr492（T320-T492），与Sestrin2的P308-T480高度相似；Sestrin1中的D418和D419与Sestrin2的DD基序高度保守。提示Sestrin1可能也通过调节GATOR1-GATOR2蛋白复合物抑制mTORC1的活性发挥抗氧化作用，D418和D419可能是Sestrin1抑制mTORC1活性的关键位点。
Sestrin2通过保守残基L351、D406、D407、D346和D364与WDR24结合，借助S190与SEH1L结合，其中DD基序是Sestrin2与GATOR2的重要结合位点[36]。蛋白互作分析显示，Sestrin1与WDR24、SEH1L发生相互作用。利用AlphaFold3预测，识别了Sestrin1与WDR24结合的保守位点为L363、D358、D376、D418和D419，与SEH1L结合的保守位点为S195，这些位点可能对Sestrin1与GATOR2之间的相互作用至关重要。KEGG/GO分析显示，Sestrin1可能调节mTOR signal pathway和细胞自噬过程，发挥其抗氧化作用。
近年来，头颈部鳞癌中Sestrin1的抗氧化功能成功吸引了低氧领域众多研究者的关注[37]。随后发现，神经元低氧损伤模型细胞的Sestrin1水平降低，其抗氧化功能明显减弱，神经元细胞凋亡水平明显升高[19]，提示Sestrin1可能在低氧诱发的氧化应激中起到保护作用。氧化应激是HAPC的重要发病机制之一[38-39]。然而，Sestrin1的抗氧化功能是否有利于HAPC的转归尚未见报道。一直以来，HAPC患者的治疗方案以缓解缺氧症状的红细胞单采术和吸氧疗法为主，缺乏更为有效的病因治疗手段。本研究通过生物信息学方法预测了Sestrin1蛋白的空间构象。基于此，推测其可能发挥抗氧化功能，参与调控氧化/抗氧化系统的平衡，这可为阐释HAPC的发病机制提供新的依据，为寻找防治靶标提供新的思路。
生物信息学方法通常依赖于已有的蛋白质结构和功能数据库，在预测蛋白质结构时无法考虑到蛋白质的动态折叠、折叠过程中的中间状态以及环境因素的影响。虽然生物信息学预测手段可以提供有价值的线索，但仍需要最终的生物学实验验证，以确定预测结果的生物学意义。由此，在后续的研究中，我们将进一步结合生物学实验，对Sestrin1的关键氨基酸残基及互作蛋白进行验证分析，以阐明其可能的抗氧化分子机制。
4 结论
通过生物信息学分析了Sestrin1蛋白的理化性质、结构及功能。作为胞内亲水蛋白，Sestrin1一方面通过SESN-A中的Cys130发挥直接抗氧化作用，另一方面通过SESN-C中的Asp418和Asp419调节mTORC1活性，发挥间接抗氧化作用。提示Sestrin1调控的氧化通路异常，可能会打破细胞内的氧化还原平衡，改变红细胞的生成、分化以及存活等多个环节，从而在 HAPC 的病理生理机制中产生重要影响。因此，深入探究 Sestrin1的抗氧化机制对于理解 HAPC 的发病机制和寻找有效的治疗策略至关重要。
