摘要
为在MAPK相关基因中寻找胃癌有关生物标志物，通过TCGA，MSigDB数据库、R包limma和wilcoxon检验对胃癌中MAPK相关基因进行差异表达分析；通过R包survival进行生存分析；通过STRING数据库构建PPI网络；通过Metascape进行富集分析；通过cibersort计算胃癌免疫细胞浸润水平。最后，使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）在20例胃癌及癌旁正常组织样本中验证差异基因的表达。结果发现胃癌中MAPK相关基因中上调基因27个，下调基因59个；生存分析发现MAPK相关基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因在胃癌组织中高表达并且影响胃癌预后。PPI网络显示差异基因表达蛋白具有广泛的相互作用；GO和KEGG功能分析显示IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因主要与EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance，MAPK signaling pathway等通路密切相关。胃癌免疫细胞浸润分析发现IL1A与肥大细胞浸润呈显著相关。RT-qPCR验证中，IL1A、MAP4K4、PDGFRB在胃癌组织中表达（1.90±0.34）、（2.10±0.44）、（2.08±0.40）均高于正常组织（0.90±0.16）、（0.96±0.18）、（1.08±0.20）；由此得出结论：胃癌中MAPK相关基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB存在差异表达且与预后相关，其中IL1A可能作为免疫治疗的潜在生物标志物。
Abstract
To search for biomarkers related to gastric cancer in MAPK related genes. Differential expression of MAPK-related genes in gastric cancer is analyzed by TCGA, MSigDB database, R-packet limma and wilcoxon test. Survival analysis is performed through R packet survival. Construct PPI network through STRING database. Enrichment analysis is performed by Metascape. The infiltration level of gastric cancer immune cells is calculated by cibersort. Finally, real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) is used to verify the expression of differential genes in 20 gastric cancer and adjacent normal tissue samples. Among the MAPK related genes in gastric cancer, 27 are upregulated and 59 are downregulated. Survival analysis revealed that MAPK related genes IL1A, MAP4K4, and PDGFRB are highly expressed in gastric cancer tissue and affect the prognosis of gastric cancer. The PPI network showed that differentially expressed gene proteins have extensive interactions. GO and KEGG functional analysis show that the IL1A, MAP4K4, and PDGFRB genes are closely related to EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance, MAPK signaling pathway, and other pathways. Analysis of immune cell infiltration in gastric cancer revealed a significant correlation between IL1A and mast cell infiltration. In RT qPCR validation, the expression of IL1A, MAP4K4, and PDGFRB in gastric cancer tissue (1.90±0.34), (2.10±0.44) , (2.08±0.40) was higher than in normal tissue (0.90±0.16), (0.96±0.18), (1.08±0.20). MAPK related genes IL1A, MAP4K4, and PDGFRB are differentially expressed in gastric cancer and are associated with prognosis. Among them, IL1A may serve as a potential biomarker for immunotherapy.
Keywords
丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是一种信号成分，MAPK信号通路可以将信号从细胞表面传递到细胞和内部，是一种三级级联传递信号通路[1]。MAPK通路在炎症和组织稳态中发挥关键作用，包括调控细胞增殖、分化和特定细胞迁移等[2-5]。MAPK通路在癌症发展中的研究表明，癌细胞可以破坏这些调节来促进增殖、生存和侵袭，包括肺癌、乳腺癌、胶质瘤和头颈部鳞状细胞癌等[5-8]。研究表明：肿瘤微环境（Tumor micro-environment，TME）在胃癌的发生、进展、预后和免疫治疗反应中有重要作用[9-10]。其中肿瘤浸润免疫细胞可产生可以调节癌症细胞增殖和迁移、促进血管生成、并参与激活宿主防御机制的细胞因子[11-13]，其可通过相应基因或通路的激活促进癌症进展。
本研究在胃癌数据库中筛选出差异表达的MAPK相关基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB作为研究对象，首先评估了其在胃癌中表达及预后，并进行了PPI网络、GO和KEGG功能富集分析及免疫浸润相关性的评估，认为IL1A可能作为胃癌诊疗和预后的一个潜在生物标志物。
1 资料与方法
1.1 数据收集
在TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）下载STAD的RNA-seq表达数据和临床数据，其中包括的样本数量为：癌组织 375，癌旁正常组织32。MAPK相关基因集合来源于MSigDB（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）。
1.2 差异基因处理和生存分析
使用R包limma筛选差异表达基因，调整后的FDR＜0.05和|fold change| ＞1.5被认为有统计学意义。使用非配对的Wilcoxon秩和检验（Wilcoxon Mann-Whitney test）来分析MAPK相关基因集合在胃癌中的差异显著性，并筛选出有显著差异的基因。随后我们使用R包survival对差异基因进行生存分析，以P＜0.05为有统计学意义。
1.3 PPI网络的构建
使用STRING（http://string-db.org）数据库来得到差异基因的交互关系。然后，使用cytoscape软件（http://www.cytoscape.org）构建和可视化一个常见的PPI网络。
1.4 功能富集分析
利用得到的PPI网络对该网络内存在的关联基因进行基于Metascape（https://metascape.org）的GO分析和KEGG通路功能富集分析。
1.5 IL1A与免疫浸润
利用CIBERSORT算法分析基因与胃癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润的相关性。分析了基因与22种肿瘤浸润免疫细胞（Tumor-infiltrating immune cells，TIICs）的表达的相关性。通过皮尔逊相关系数计算基因与肿瘤浸润免疫细胞的相关性。
1.6 临床样本收集
选取2023年3月至2023年5月在河北医科大学第四医院外科行根治性手术的20例胃癌患者（所有患者术后病理检查均表现为腺癌，均未在手术前接受过任何治疗或伴有任何其他癌症）。从每个患者术后标本中取出相同大小的肿瘤组织和相应的癌旁正常组织，放入标记的组织冷冻管中。在液氮罐中速冻后被转移到-80℃冰箱中保存。
1.7 RT-qPCR验证IL1A、MAP4K4、PDGFRB在胃癌及正常组织中的表达水平
选取20例术后病理证实为胃腺癌的患者的胃癌组织及正常黏膜组织标本进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测IL1A、MAP4K4、PDGFRB的表达水平。用TRIzol试剂（15596018，赛默飞世尔科技公司）提取胃癌组织及正常黏膜组织中的总RNA，应用分光光度计计算RNA纯度及浓度。使用RevertAid First Strand cDNA 合成试剂盒，含 DNase I（K16215，赛默飞世尔科技公司）按说明书操作合成cDNA。在单链cDNA中加入相应引物，加入 SYBRTM Green PCR 预混液（A25742，赛默飞世尔科技公司）在StepOne实时荧光定量PCR系统（4376357，赛默飞世尔科技公司）上按说明书进行qPCR扩增。每个实验进行三个独立的重复。相对基因表达标准化为β-actin并通过2-△△Ct方法计算。IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。相关引物序列为：
IL1A：5′-AGATGCCTGAGATACCCAAAACC-3′;
5 ′-CCAAGCACACCCAGTAGTCT-3′；
MAP4K4：5′-GACTCCCCTGCAAAAAGTCTG-3′
5 ′-GTCCATAGGTGCCATTTCCAA-3′；
PDGFRB：5′-AGACACGGGAGAATACTTTTGC-3′
5 ′-AGTTCCTCGGCATCATTAGGG-3′；
β-actin：5′-TGAGACATTCAACACCCCTG-3′
5 ′-CCTTCATAGATTGGGACAGTG-3′。RT-qPCR共进行20次生物学重复。
1.8 统计分析
采用R软件进行生物信息学分析。Wilcoxon秩和检验检测MAPK相关基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB在组织中的差异表达情况。R包survival反映基因表达是否影响胃癌患者的生存。皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient，PCC）计算基因IL1A与免疫细胞相关性。组间比较采用方差分析和t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌中MAPK相关基因表达
MAPK相关基因集合共有267个基因，应用阈值（FDR＜0.05，|fold change| ＞1.5，图为取log后结果）在胃癌数据库中筛选差异表达的MAPK相关基因，其中癌组织中有27个基因表达上调，59个基因表达下调，我们使用火山图可视化了差异基因，红点代表上调，蓝点代表下调（图1（a））。使用热图对差异表达基因进行了展示（图1（b）），然后进行生存分析。
2.2 MAPK相关基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB与胃癌预后密切相关
通过R包survival进行生存分析，曲线结果显示IL1A、MAP4K4、PDGFRB高表达患者具有较差的预后，低表达的患者预后时间较长。其中，IL1A高表达组5年生存率为33.10%，中位生存时间为638.12 d，低表达组5年生存率为35.31%，中位生存时间为1 288.60 d（χ2=5.29，P=0.021；图2（a））；MAP4K4高表达组5年生存率为22.50%，中位生存时间为633.70 d，低表达组5年生存率为45.32%，中位生存时间为1 685.10 d（χ2=6.88，P=0.009；图2（b））；PDGFRB高表达组5年生存率为20.80%，中位生存时间为749.20 d，低表达组5年生存率为49.50%，中位生存时间为1 392.00 d（χ2=6.06，P=0.014；图2（c））。
Wilcoxon秩和检验结果显示IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因在胃癌组织中表达（13.31±2.07）、（18.07±0.62）、（18.96±1.06）高于癌旁正常组织（11.21±5.08）、（17.34±0.57）、（17.73±1.04）、且离散程度相对集中。（P=0.003；P＜0.001；P＜0.001；图2（d）~2（f））。
图1胃癌中MAPK相关基因存在差异表达
Fig.1Differential expression of MAPK related genes in gastric cancer
注：（a）差异基因火山图；（b）差异基因热图.
图2IL1A、MAP4K4、PDGFRB的生存分析与差异表达
Fig.2Survival analysis and differential expression of IL1A, MAP4K4, and PDGFRB
注：（a）IL1A的生存分析；（b）MAP4K4的生存分析；（c）PDGFRB的生存分析；（d）IL1A的差异表达量；（e）MAP4K4的差异表达量；（f）PDGFRB的差异表达量.
2.3 IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因的PPI网络和功能富集分析
构建PPI网络来进一步探索差异基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB之间的相互作用，IL1A、MAP4K4，PDGFRB蛋白之间及与其他蛋白具有广泛的相互作用（图3（a））。为深入了解差异基因在胃癌中的生物学功能，对PPI中的差异基因进行了GO分析和KEGG通路功能富集分析。GO分析中的生物学过程（Biological process，BP）结果显示：差异基因与细胞迁移的正向调节，磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的调控，细胞活化的调节，肽基酪氨酸磷酸化的调控，细胞粘附的负调控，细胞活化有关。KEGG通路分析显示：差异基因与EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性，MAPK信号通路，癌症中PD-L1的表达和PD-1检查点通路有关（图3（b））。
2.4 IL1A与免疫浸润有关
深入分析IL1A、MAP4K4、PDGFRB与胃癌免疫细胞浸润的关系。结果表明，IL1A的表达与肿瘤免疫细胞浸润密切相关。在胃癌组织样本中IL1A、MAP4K4、PDGFRB的表达水平与22个TIICs的表达谱的关系如图4（a）所示。深入研究发现IL1A与静止期肥大细胞（Mast cells resting）呈负相关；与活动期肥大细胞（Mast cells activated）呈正相关（图4（b））。
2.5 RT-qPCR验证IL1A，MAP4K4，PDGFRB在胃癌组织中的表达水平
对20例胃癌组织及正常黏膜组织的RT-qPCR结果显示IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因在胃癌组织中表达（1.90±0.34）、（2.10±0.44）、（2.08±0.40）均高于癌旁正常组织（0.90±0.16）、（0.96±0.18）、（1.08±0.20）。（t=11.88，P＜0.001；t=10.77，P＜0.001；t=10.13，P＜0.001；图5（a）~5（c））。
3 讨论
胃癌是全球第五大最常见的癌症和第三大最常见的癌症死亡原因[14]，因其高患病率和低生存率而成为一个全球性的健康挑战[15]。近年来，免疫治疗被认为是晚期胃癌患者的可靠选择[16]。然而，由于免疫反应的复杂性，只有少数患者获得了有效结果[17]，因此，有必要开发潜在的生物标志物及治疗靶点。既往研究通过生物信息学发现了一些胃癌相关的潜在生物标志物，例如，Qing等[18]基于GEO和TCGA数据库鉴定了36个胃癌相关血管生成相关基因，并在其预后特征与免疫治疗方面有显著意义；Ma等[19]发现RHOJ可能是胃癌侵袭转移的潜在生物标志物。
图3IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因的PPI网络和功能富集分析
Fig.3PPI network and functional enrichment analysis of IL1A, MAP4K4 and PDGFRB genes
注：（a）IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因的PPI网络；（b）GO及KEGG功能富集分析.
图4IL1A、MAP4K4、PDGFRB与免疫细胞的关系
Fig.4Relationship between IL1A, MAP4K4, PDGFRB and immune cells
注：（a）以IL1A、MAP4K4、PDGFRB为观察对象的肿瘤免疫细胞浸润；（b）IL1A与肥大细胞的皮尔逊相关系数.
MAPK通路可以被多种因素如细胞因子、氧化应激等激活[20]。既往研究表明，IL1A与MAPK通路相关的上调有关，有助于MAPK的激活和炎症因子的表达。IL-1α是白细胞介素（Interleukin，IL）-1细胞因子家族成员，是由IL1A基因编码的细胞因子，在炎症和癌症中有多重作用。IL1A通过IL-1R发出信号，IL-1R信号表达可由MAPK通路激活下游IL-1R诱导生产促炎介质如COX-2、IL-6、TNF、进一步促进生产IL1A[21-23]。已有研究表明，恶性细胞、肿瘤浸润性免疫细胞和基质细胞均可表达IL-1α和IL-1R、IL-1信号通路通过不同的方式影响肿瘤的进展，如，IL-1R信号通路导致炎症介质IL-6和COX2的表达，从而促进恶性细胞的生存和增殖；IL1A信号通路可促进趋化因子等细胞因子表达，促进肿瘤侵袭和免疫逃逸[21-23]。
图5RT-qPCR验证IL1A、MAP4K4、PDGFRB在胃癌组织中表达高于正常组织
Fig.5RT-qPCR verified that the expression of IL1A, MAP4K4 and PDGFRB in gastric cancer tissues was higher than that in normal tissues
注：（a）IL1A表达水平；（b）MAP4K4表达水平；（c）PDGFRB表达水平.
丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶-4 （Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase-4，MAP4K4）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，MAPK通路的一个上游激活因子，已知在炎症和恶性疾病中发挥重要作用。MAP4K4信号转导参与细胞增殖、侵袭性、黏附性、炎症和应激反应等。近年来，一些研究表明，MAP4K4在包括胃癌的许多癌症的中发挥作用[24-25]。MAP4K4主要通过三个方面起作用：细胞增殖途径的激活、细胞骨架功能的改变和抗肿瘤免疫反应的损害，如髓母细胞瘤中MAP4K4可以通过控制c-Met内吞作用和整合素B1的激活使细胞骨架发生改变，这与其侵袭有关[26]。血小板衍生生长因子受体-β（Platelet-derived growth factor-beta，PDGFRB）在血管生成和肿瘤细胞增殖中起关键作用，并已被认为是癌症的预后标志物。PDGFRB的表达在多种肿瘤中增加，包括胃肠道肿瘤、肺癌、乳腺癌、肝细胞癌[27]。PDGFRβ信号传导被证明可以通过激活PI3K/AKT和Ras/MAPK通路促进肿瘤细胞的增殖、转移和血管生成[28]。本研究通过生物信息学分析将MAPK相关基因IL1A、MAP4K4、PDGFRB确定为胃癌中差异表达基因，并进行了功能分析。功能分析表明：IL1A、MAP4K4、PDGFRB基因与MAPK信号通路有关，但具体机制还有待深入分析。
此外，肿瘤微环境可以反映患者的预后和肿瘤免疫治疗的疗效。其中的免疫细胞可以干扰肿瘤的信号通路并影响肿瘤的预后，而且浸润的免疫细胞的密度对多种癌症的预后也有至关重要的影响[29-30]。有研究表明，IL1A以分泌形式为主时，是肿瘤微环境中的一种高度促炎的细胞因子，通常会增加肿瘤的生长和侵袭性。而IL1A以膜形式为主时可以激活免疫介导的抗肿瘤反应[31-33]。免疫检查点抑制是晚期胃癌的一种有前景的治疗方法，并推动了基础研究和临床实践的发展[34-36]。肿瘤细胞可通过各种机制导致免疫逃逸[35]。不同的免疫检查点抑制剂可针对肿瘤和免疫细胞上的不同分子通路，如CTLA-4和 PD-1/PD-L1 等在肿瘤诱导的免疫抑制中的重要性。有研究表明，T 细胞、B 细胞等表达的PD-1与抗原呈递细胞和肿瘤细胞的PD-L1结合可激活免疫抑制通路，促进肿瘤免疫逃逸[35]。PD-1/PD-L1抑制剂在治疗晚期癌症方面显示巨大潜力[37]。许多临床研究报告称，只有小部分患者的免疫治疗有一定的良好效果，而大多数患者的免疫治疗结果不令人满意。预测各种免疫疗法在不同阶段胃癌的疗效仍然是一个挑战，这需要继续探索潜在的生物标志物。本研究通过富集分析和免疫细胞浸润分析发现，IL1A可能通过参与免疫细胞进入肿瘤组织的生物学过程，改变患者的肿瘤微环境，并可能影响胃癌的发展和患者预后。该结果表明，IL1A是一种肿瘤预后预测因子，也是可能的肿瘤治疗靶点，为胃癌治疗提供了一种具有免疫调节功能的新型分子。
总之，通过数据分析与整理，总结出MAPK相关基因IL1A在胃癌细胞中高表达，并显著影响胃癌预后。并且IL1A的表达可以与广泛蛋白结合并通过MAPK通路、PD1/PDL1检查点通路参与胃癌发展。IL1A的过表达与肿瘤细胞免疫浸润有关，并且可能通过活化肥大细胞参与胃癌发展，这从另一个角度阐述了IL1A与胃癌患者预后较差的相关性。由此可推断IL1A可能作为胃癌免疫治疗的潜在生物标志物。
