摘要
运用网络药理学和分子对接技术研究消瘿贴穴位贴敷治疗桥本甲状腺炎（HT）的潜在作用机制。在TCMSP中药系统药理学平台、HERB本草组鉴、BATMAN数据库和公开发表的文献中检索消瘿贴的主要成分和相应的蛋白质靶标。在GeneCards数据库收集HT的靶点，构建韦恩图获得复合靶标和疾病的交集靶点，并将靶标导入STRING数据库，使用Cytoscape 3.10.2软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。对交集靶点进行基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）, Reactome, WikiPathways富集分析，以探索HT与消瘿贴的相关信号通路。对关键靶点和活性化合物进行分子对接研究。共获得消瘿贴的292种潜在活性化合物、3434个疾病靶点与381个药物靶点，并得到261个交集靶点。通过PPI网络分析确定了10个关键靶点，Degree值排名前5位的靶点包括肿瘤蛋白P53（TP53）、蛋白激酶B1（AKT1）、转录因子AP-1（JUN）、肿瘤坏死因子（TNF）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）。GO、KEGG、Reactome和WikiPathways分析表明，消瘿贴治疗HT主要涉及RNA聚合酶II启动子的转录正调控、基因表达的正向调控、凋亡过程的负调控等生物学过程，信号通路主要包括白介素相关信号通路、PI3K/AKT、AGE-RAGE信号通路。分子对接结果表明，SRC与isorhamnetin具有较高的结合活性。槲皮素、芹菜素、β-谷甾醇、异鼠李素、甲氧基丁香酚是重要的活性化合物并通过分子对接模拟进行验证。本研究从多个角度阐明消瘿贴可能通过调节多个靶点和多条途径对HT起到治疗作用，可为进一步深入研究消瘿贴对HT的治疗作用提供科学依据。
Abstract
To clarify the potential mechanism of Xiaoying plaster in the treatment of Hashimoto's thyroiditis(HT) based on network pharmacology and molecular docking techniques. The main components and corresponding protein targets of Xiaoying plaster are searched in the TCMSP, HERB, BATMAN and papers. The targets of HT are collected from the GeneCards databases. A Venn diagram is constructed to obtain the intersection targets between the compound targets and disease targets, and the qualified targets are imported into the STRING database. The protein-protein interactions network is constructed using Cytoscape 3.10.2 Gene Ontology(GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG), Reactome and WikiPathways enrichment analyses are performed on the intersection targets to explore the relevant signaling pathways of HT and Xiaoying plaster. Molecular docking studies.A total of 292 active components, 3434 HT related targets, 381 interaction targets, and 261 intersection targets of Xiaoying plaster are collected. Through PPI network analysis, 10 key targets are identified, with the top five targets ranked by Degree values including tumor protein p53(TP53), protein kinase B1(AKT1), transcription factor AP-1(JUN), tumor necrosis factor(TNF), and sarcoma(SRC). GO, KEGG, Reactome and WikiPathways analyses indicated that Xiaoying plaster's treatment of HT mainly involves biological processes such as positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter, positive regulation of gene expression, and negative regulation of apoptotic process. The signaling pathways mainly include the Signaling by Interleukins, PI3K-Akt, and AGE RAGE pathway. Molecular docking results show that SRC exhibited high binding activity with isorhamnetin. Quercetin, kaempferol, oleic acid, beta-elemene, eugenol, apigenin, and Methyleugenol are important active compounds and are verified through molecular docking simulations. This study clarifies from multiple perspectives that Xiaoying plaster may exert therapeutic effects on HT by regulating multiple targets and pathways, providing a scientific basis for further investigating the effects of Xiaoying plaster on HT.
桥本甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT）是一种自身免疫性甲状腺疾病，女性发病率显著高于男性[1]，是导致甲状腺功能减退的主要原因，也是甲状腺乳头状癌发生的危险因素[2]。近年来，HT的发病率呈上升趋势[3]。如何有效治疗HT成为现代医学研究的关注点。目前尚无治愈和针对HT病因治疗的方法，西医治疗主要在于纠正甲状腺功能的异常[4]。临床最常用的药物为左甲状腺素，患者往往需要终身服药以维持正常循环的促甲状腺激素水平[5]。另外，糖皮质激素、泼尼松龙、硒、维生素D补充剂、手术治疗亦可见使用，但基于有效性、多并发症、高风险性、低收益性等因素综合分析，上述方法仍存在质疑[6-9]。
HT属于中医“瘿病”范畴，治疗重在疏肝理气、软坚散结[10]。穴位贴敷属于传统中医外治法之一，消瘿贴是课题组依据HT患者的基本病机和临床经验所得，其组成包括：高良姜、芒硝、白芥子、细辛、沙蒿子、水蔓菁、薄荷脑。高良姜性热味辛，纯阳上升。柳俊辉等[11]研究证实高良姜能够提高大鼠的甲状腺机能。芒硝性寒味咸苦，可软坚化滞。日本医家吉益南涯认为芒硝属气部药，可理气消瘿[12]。白芥子性温味辛，软坚散结，善化痰涎。研究[13]表明，白芥子具有抗菌作用。细辛性温味辛，《山海经》载“有草焉，其状如葵，其臭如蘼芜，名曰杜衡，可以走马，食之已瘿”[14]。沙蒿子具有抗炎、止痛、杀菌、增强免疫的作用[15]。水蔓菁性微寒味苦，具有抗菌的作用[16]。薄荷脑最早分离于薄荷的茎和叶，具有抗炎、镇痛、促进透皮吸收等药理作用[17-19]。课题组通过前期研究发现，消瘿贴可有效降低HT患者血清甲状腺球蛋白抗体、甲状腺过氧化物酶抗体水平，缓解甲状腺肿大程度，同时改善中医证候，缓解焦虑情绪，提高生活质量，临床疗效可靠，且安全性良好[20-21]，但其作用机制尚不明确，需要进一步探索。因此，本研究运用网络药理学和分子对接技术研究消瘿贴治疗HT的潜在作用机制，为临床治疗HT提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 消瘿贴活性成分及相关靶点筛选
运用TCMSP中药系统药理学平台（https://www.tcmsp-e.com/#/home）、HERB本草组鉴（http://herb.ac.cn）、BATMAN数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）以及公开发表的文献，检索“高良姜”、“芒硝”、“白芥子”（校正名称为“芥子”）、“细辛”、“沙蒿子”（校正名称为“黑沙蒿”）、“水蔓菁”和“薄荷脑”的活性成分和潜在靶点。因本研究的干预措施为消瘿贴穴位贴敷，故未将口服生物利用度（OB）及类药性（DL）作为筛选条件，而选择将检索得到的全部成分纳入分析。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org）标准化处理靶点名称，Status下选择Reviewed，Popular organisms下选择Human，得到消瘿贴的活性成分和潜在靶点。
1.2 HT靶点基因的获取
使用GeneCards数据库（https://www.genecards.org）收集HT的相关靶点。将药物靶点与疾病靶点输入VENNY 2.1在线作图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），绘制韦恩图，并寻找消瘿贴与HT的交集靶点基因。应用GraphPad Prism 9软件进一步规范韦恩图格式。
1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interactions，PPI）网络构建
将消瘿贴对HT的有效靶点基因输入STRING数据库（https://cn.string-db.org），Organisms选择Homo sapiens，minimum required interaction score选择highest confidence（0.900），network display options选择hide disconnected nodes in the network，预测PPI互作关系。运用Cytoscape3.10.2软件绘制PPI网络图，取度值（Degree）排名前10位的核心靶点进行可视化分析。
1.4 构建消瘿贴化合物-靶点网络
在Cytoscape3.7.0软件中导入消瘿贴潜在化合物及对应靶点基因，构建消瘿贴化合物-靶点网络图。
1.5 基因本体（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析
利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）对共同靶点进行GO，KEGG通路富集分析，筛选出前20位的生物过程和信号通路。其中GO富集分析包含生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cell component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3个方面。使用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn）对GO、KEGG通路富集分析结果进行可视化处理。
1.6 Reactome，WikiPathways信号通路富集分析
在WikiPathways数据库（https://www.wikipathways.org）中导入潜在作用靶点信息，进行通路富集分析，采用R 4.4软件中的clusterProfiler 4.12.0进行可视化操作。使用R 4.4软件中的clusterProfiler 4.12.0和ReactomePA 1.48.0进行Reactome信号通路富集分析。
1.7 分子对接
使用AutoDock Vina1.2.5软件，选择Degree排名前5位的关键靶点蛋白为受体，对应排名前5位的化合物为配体进行分子对接，初步验证结合程度。
2 结果
2.1 筛选消瘿贴活性成分及收集基因靶点
在TCMSP中药系统药理学平台、HERB本草组鉴、已发表文献中检索消瘿贴有效活性成分，共筛选出高良姜130个、芒硝4个、芥子51个、细辛192个、黑沙蒿115个、水蔓菁59个、薄荷脑1个有效活性成分，经剔重、校正、筛选，最终得到292个有效活性成分和381个作用靶点。
2.2 HT靶点筛选
在GeneCards数据库收集HT靶点。GeneCards数据库靶点与疾病关系越密切，其对应的Relevance score值越高。由于Relevance score值≥30的靶点数量过少，故未对在GeneCards数据库得到的靶点进行筛选，最终得到HT靶点3 434个。
2.3 消瘿贴-活性成分-疾病的交集靶点
将3 434个疾病靶点与381个药物靶点导入VENNY 2.1在线作图工具，得到消瘿贴作用于HT的潜在作用靶点261个，见图1。
图1消瘿贴-HT韦恩图
Fig.1Venn diagram of Xiaoying plaster-HT
2.4 PPI网络构建与核心靶点筛选
将获得的261个交集靶点导入STRING数据库，将导出的tsv文件导入Cytoscape3.10.2软件，对蛋白关系进行可视化分析，见图2。运用Cytoscape3.10.2软件对Degree值进行计算分析，得到228个节点及941条边。Degree值排名由高到低依次为肿瘤蛋白P53（Tumor protein p53，TP53）、蛋白激酶B1（Protein kinase B1，AKT1）、转录因子AP-1（Transcription factor AP-1，JUN）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Sarcoma，SRC）、E1A结合蛋白P300（E1A binding protein p300，EP300）、雌激素受体1（Estrogen receptor 1，ESR1）、丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase1，MAPK1）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL6）、蛋白激酶cAMP激活催化亚基α（Protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alpha，PRKACA），此10个基因是消瘿贴治疗HT中作用的主要靶蛋白（表1）。PPI网络图（图2、图3）的节点越大、颜色越深表示该靶点越重要。
图2PPI网络图
Fig.2PPI network diagram
表1消瘿贴治疗HT的潜在核心靶点
Table1Potential core target of Xiaoying plaster in the treatment of HT
图3核心靶点PPI网络图
Fig.3PPI network diagram of core target
2.5 消瘿贴-有效成分-治疗靶点可视化分析
将药物潜在化合物及对应靶点基因导入Cytoscape3.7.0软件，绘制药物-有效成分-治疗靶点网络图（图4），包含679个节点和4 011条边，颜色深浅、节点大小与Degree值呈正相关。按Degree值排列得到前20位消瘿贴主要活性化合物（表2），其中槲皮素（Quercetin）潜在治疗疾病靶点最多，有143个，其次为山奈酚（Kaempferol）、油酸（Oleic acid）、β-榄香烯（Beta-elemene）、丁香酚（Eugenol）、芹菜素（Apigenin）、甲基丁香酚（Methyleugenol）、（-）-萜品-4-醇（（R）-p-Menth-1-en-4-ol）、棕榈酸（Palmitic acid）、α-松油烯（Terpilene）、α-松油醇（（L）-alpha-Terpineol）、R-芳樟醇（（R）-linalool）、β-蒎烯（（-）-β-pinene）、特雷本（Tereben）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、异鼠李素（Isorhamnetin）、L-乙酸龙脑酯（L-Bornyl acetate）、甲氧基丁香酚（Methoxyeugenol）、辣椒碱（Capsaicin）、大黄素（Emodin）。上述高连接度活性化合物可能在消瘿贴治疗HT中发挥主要药理作用。
图4消瘿贴-有效成分-治疗靶点网络图
Fig.4Diagram showing the Xiaoying plaster-active ingredients-therapeutic target network
2.6 GO富集分析
通过GO富集分析结果初步检验筛选的消瘿贴靶点与HT的相关性，得到BP 944条，CC 121条和MF197条。选取每部分排名前20位者建立柱状图，见图5。BP富集结果可知，靶点主要生物过程包括RNA聚合酶II启动子的转录正调控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、基因表达的正向调控（Positive regulation of gene expression）、凋亡过程的负调控（Negative regulation of apoptotic process）、炎症反应（Inflammatory response）等。CC富集结果可知，靶点组成成分涉及胞浆（Cytosol）、细胞质（Cytoplasm）、细胞核（Nucleus）等。MF富集结果可知，主要靶点功能涉及蛋白结合（Protein binding）、酶结合（Enzyme binding）、蛋白质同二聚化活性（Protein homodimerization activity）、蛋白激酶结合（Protein kinase binding）等。
2.7 信号通路富集分析
主要使用KEGG、Reactome、WikiPathways等工具对靶点相关通路进行分析。
2.7.1 KEGG富集分析结果
DAVID数据库显示靶点参与204条KEGG通路，并将Count排名前20者做KEGG富集分析，见图6。结果显示，糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、白细胞介素17信号通路（IL-17 signaling pathway）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等多条通路与HT的发生发展存在较强的相关性。
表2消瘿贴主要活性化合物
Table2Main active compounds of Xiaoying plaster
2.7.2 Reactome富集分析结果
利用Reactome富集对消瘿贴和HT交集基因进行分析，选取影响最大的前20条通路进行Reactome富集分析，见图7。结果显示，靶点参与349条Reactome通路，消瘿贴通过包含白介素相关信号通路（Signaling by interleukins），白细胞介素-4和白细胞介素-13信号转导通路（Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling），癌症中的PI3K/AKT信号通路（PI3K/AKT Signaling in Cancer），白细胞介素-10信号（Interleukin-10 signaling）等在内的多条通路发挥治疗作用。
2.7.3 WikiPathways富集分析结果
经过WikiPathways通路富集分析共得到427条通路，选取排名前20者绘制气泡图（图8）。与HT相关的信号通路主要包括晚期糖基化终末产物晚期糖基化终产物受体通路（AGE RAGE pathway）、IL18信号（IL18 signaling）等，推测消瘿贴主要通过这些途径起到治疗HT的作用。
2.8 分子对接验证
将关键靶点基因（TP53、AKT1、JUN、TNF、SRC）与对应排名前5位的化合物（Quercetin，apigenin，beta-sitosterol，isorhamnetin，Methoxyeugenol）进行分子对接。一般认为，结合能≤-5.0 kcal·mol-1的药物分子与靶点具有较好的结合活性。结果显示：HT核心靶点与消瘿贴主要活性成分分子对接结合能均≤-5.0 kcal·mol-1，表明消瘿贴活性成分对于HT关键受体有良好的结合活性，可能在治疗HT过程中发挥重要作用（表3）。其中，对接最稳定的是isorhamnetin与SRC的结合（-10.2 kcal·mol-1）。取结合能较强的结果（排名前6）进行可视化（图9），分别为isorhamnetin与SRC（-10.2 kcal·mol-1），quercetin与SRC（-10.1 kcal·mol-1），apigenin与SRC（-9.8 kcal·mol-1），beta-sitosterol与SRC（-8.9 kcal·mol-1），isorhamnetin与TNF（-7.1 kcal·mol-1），quercetin与TNF（-7 kcal·mol-1）。图中蓝色为靶点蛋白，绿色为化合物，黄色为氢键。（彩图见电子版）。
图5消瘿贴治疗HT的GO富集分析柱状图
Fig.5GO enrichment analysis histogram of Xiaoying plaster in the treatment of HT
3 讨论
本研究的主要目的是探讨消瘿贴治疗HT的潜在机制。通过检索TCMSP中药系统药理学平台、HERB本草组鉴、BATMAN数据库和公开发表的文献共收集到292种化学成分，其中主要化学成分包括槲皮素、芹菜素、β-谷甾醇、异鼠李素、甲氧基丁香酚，这些主要化学成分可以与其他活性成分一起作用于网络中的多个靶标。其中，槲皮素具有免疫调节、抗炎、抗氧化、调节细胞关键酶功能等作用，能够参与多种炎症相关信号通路分子间相互作用，具有降低细胞因子、趋化因子及炎症相关酶活性的作用[22]。同时，槲皮素具有抑制甲状腺细胞生长，下调钠/碘转运基因水平的作用[23]，而且能够下调促甲状腺激素受体（Thyrotropin Receptor，TSHR），甲状腺过氧化物酶（Thyroid Peroxidase，TPO）和甲状腺球蛋白（Thyroglobulin，Tg）基因，显著抑制放射性碘摄取[24]。芹菜素能够通过直接抑制NF-κB信号通路和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体激活，减轻炎症反应[25]。β-谷甾醇是一种能够调节免疫、抑制癌症的植物甾醇，研究[26]表明β-谷甾醇能够提高体外T、NK细胞的增殖活性。异鼠李素与槲皮素结构类似，具有抑制IL-6表达的作用[27]，而IL-6与自身免疫性甲状腺炎（Autoimmune Thyroiditis，AIT）密切相关[28-29]。研究[30]表明，甲氧基丁香酚可抑制多种癌细胞。
图6消瘿贴治疗HT的KEGG通路富集分析条形图
Fig.6Bar chart showing the KEGG pathway enrichment analysis of Xiaoying plaster in the treatment of HT
图7消瘿贴治疗HT的Reactome通路富集分析气泡图
Fig.7Bubble chart showing the reactome pathway enrichment analysis of Xiaoying plaster in the treatment of HT
图8消瘿贴治疗HT的WikiPathways富集分析气泡图
Fig.8Bubble chart showing the WikiPathways enrichment analysis of Xiaoying plaster in the treatment of HT
表3分子对接情况
Table3Molecular docking situation
本研究从GeneCards数据库收集HT的相关靶点。根据STRING构建的PPI网络可视化分析后，得到关键靶点TP53、AKT1、JUN、TNF和SRC，这些核心基因与HT有着一定的联系。TP53基因具有调节细胞周期、凋亡和心血管形成的作用，也是重要的抑癌基因[31]。HEIDARI等[32]研究发现，TP53在甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid cancer，PTC）患者中的表达显著降低，失去TP53调控的甲状腺组织获得PTC易感性而演变为甲状腺癌。AKT1作为一种细胞存活途径的中枢传感器，其水平在HT患者甲状腺组织内较正常人显著升高，在细胞存活、凋亡及炎症反应的平衡之间发挥重要作用[33]。研究发现，T细胞和Treg细胞中的AKT1呈抑制状态，而这与自身免疫性疾病多发性硬化相关[34]。JUN是调节细胞增殖、分化和凋亡的关键转录因子[35]，其异常表达或活化与多种肿瘤和自身免疫性疾病的发生发展有关[36]。TNF作为一种炎症因子，能够直接或间接地损伤甲状腺组织，干扰免疫耐受机制，导致或加重HT的发生、发展，进一步影响其临床转归和预后。SRC蛋白激酶广泛表达于正常组织的细胞中，在调控信号转导中发挥关键作用，其表达过量时可能会诱导癌症的发生[37]。
图9分子对接可视化图
Fig.9Molecular docking visualization
本研究通过对关键靶点进行GO富集分析，结果发现其中BP主要涉及RNA聚合酶II启动子的转录正调控、基因表达的正向调控、凋亡过程的负调控等。CC富集分析可知，靶点主要包含胞浆、细胞核、细胞质等细胞相关组成部分。通过MF富集分析可知，主要靶点功能与蛋白结合、酶结合等有关。基于KEGG、Reactome、WikiPathways富集分析结果显示，消瘿贴可通过多条信号通路调控HT。其中，白介素相关信号通路、PI3K/AKT、AGE-RAGE信号通路可能是消瘿贴治疗HT的重要通路。白介素相关信号通路是HT相关的经典炎症信号通路。PI3K/AKT通路可以激活趋化因子受体和促进白细胞迁移，调节细胞生存、细胞凋亡和炎症反应间的平衡[38]。AGE-RAGE信号通路与炎症相关。有研究[39]报道，AGE可激活PI3K/AKT信号通路，而阻断PI3K/AKT信号通路会减弱AGE诱导的细胞增殖。
此外，本研究尚存在一定的局限性。首先，网络药理学研究依赖相关数据库的完整性、实时性，而当前分子对接技术与体内环境尚存在一定的差异，因此未来仍需对研究所得的相关靶点及分子机制进行实验验证。其次，消瘿贴治疗HT的潜在机制涉及多种药理作用，因此需要结合转录组、蛋白质组和代谢组等高通量检测技术揭示其复杂的协同机制。
4 结论
本研究基于网络药理学和分子对接技术，系统阐述了消瘿贴通过“多成分、多靶点”模式治疗HT的药效成分和潜在机制。结果表明，消瘿贴中槲皮素、芹菜素、β-谷甾醇、异鼠李素、甲氧基丁香酚等活性成分主要通过作用于TP53、AKT1、JUN、TNF和SRC等靶点，干预PI3K/AKT、AGE-RAGE、白介素等相关信号通路，进而调控基因表达的正向调控、凋亡过程的负调控等生物过程，参与蛋白结合、酶结合等，从而实现对HT的干预。该研究为消瘿贴的深入研究、临床应用和二次开发提供了有益的参考及科学依据。
致谢：感谢冯丹丹（浙江中医药大学附属第一医院乳腺外科），张梦棣、潘景龙、梁鸿艺（山东中医药大学第一临床医学院），李颖慧（淄博高新技术产业开发区四宝山卫生院医保科），崔桂萍（山东中医药大学中医学院），浦冬青（山东中医药大学附属医院乳腺甲状腺外科）在课题设计、方案论证及课题实施等方面给予的指导和帮助！
