摘要
膀胱癌（BLCA）的高复发率和预后不良是其治疗失败的主要原因。溶酶体作为癌症治疗的潜在靶点一直受到广泛关注。然而，溶酶体相关基因（LRG）在BLCA中的作用仍然不明确。本研究采用综合方法，利用差异分析、单因素Cox回归、Lasso、随机森林和多因素Cox回归，来开发LRG评分。然后，将BLCA患者分为高分组和低分组，以检查LRG评分与各种结果之间的关联，包括预后、功能富集、免疫浸润、免疫治疗和单细胞水平功能。筛选结果得到了5个基因（COL6A1、CTSV、GPC2、GZMH和LRP1）用于构建LRG评分。发现LRG评分低的患者预后显著更好，并且对免疫治疗的反应优于LRG评分高的患者。基于从bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq中获得的结果，确定细胞外基质重塑相关过程是高分组和低分组之间的主要区别因素。总之，本研究设计了一个新型LRG评分，并证实了LRG评分在未来临床评估和治疗干预中具有可靠性和适用性，从而为预测BLCA预后提供了有价值的见解。
Abstract
The high recurrence rate and poor prognosis of bladder cancer (BLCA) are the primary causes of treatment failure. Lysosomes have garnered significant attention as potential therapeutic targets in cancer. However, the role of lysosome-related genes (LRGs) in BLCA remains unclear. This study employs a comprehensive approach involving differential analysis, univariate Cox regression, Lasso, random forest, and multivariate Cox regression to develop an LRG score. BLCA patients are classified into high- and low-score groups to examine associations between the LRG score and multiple outcomes, including prognosis, functional enrichment, immune infiltration, immunotherapy response, and single-cell-level functional characteristics. Screening identifies five genes (COL6A1, CTSV, GPC2, GZMH, and LRP1) for constructing the LRG score. The low LRG score group exhibits a significantly better prognosis and demonstrates superior response to immunotherapy compared to the high-score group. Based on bulk RNA-seq and single-cell RNA-seq analyses, extracellular matrix remodeling-related processes are identified as the primary distinguishing factor between the two groups. In conclusion, this study designs a novel LRG score and confirms its reliability and applicability in future clinical assessment and therapeutic interventions, providing valuable insights for predicting BLCA prognosis.
Keywords
膀胱癌（BLCA）是一种全球范围内广泛存在的恶性肿瘤，其高发病率与死亡率给社会带来了沉重的负担[1]。BLCA临床上主要分为两大亚型：肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）与非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）[2]。尽管NMIBC患者通常享有较高的5年生存率，但这一群体中约有15%~20%的患者将面临疾病进展的风险，进而导致其生存率显著滑落至60%[3]。虽然医疗技术不断进步，手术、化疗等治疗方案在BLCA治疗中取得了显著成效，但对于晚期BLCA患者而言，其预后状况依然不容乐观[4-5]。因此，开发可靠的膀胱癌风险模型以区分不同风险的患者对于帮助预测预后和个性化治疗至关重要。
溶酶体是一种由酸性管腔构成的细胞器[6]。作为细胞内的关键信号调控与降解枢纽，溶酶体在细胞的生长、衰老、发育及维持稳态过程中扮演着不可或缺的角色[7]。近年来，多项研究证据揭示了溶酶体与肿瘤学领域的紧密联系[8-10]。已有研究发现溶酶体相关蛋白跨膜4β（LAPTM4B）基因在肝细胞癌组织中上调，其表达与预后不良和肿瘤侵袭性增加有关[11]。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中，研究人员分析了溶酶体相关基因在HNSCC中的表达和预后意义，从而鉴定了 2 种不同的分子亚型，开发了基于溶酶体相关基因的风险模型[12]。在肺腺癌（LUAD）中，有研究使用GATA2、TFAP2A、LMBRD1和KRT8四种溶酶体相关基因构建了LUAD患者的重要预后模型[13]。值得注意的是，尽管溶酶体在生物学和医学领域的重要性日益显著，但关于多个溶酶体相关基因如何协同作用影响膀胱癌的具体机制，迄今仍鲜有研究报道。
在这项研究中，我们在BLCA中基于机器学习开发了一种新型溶酶体相关基因（LRG）评分。随后，试图评估这一LRG评分在2个独立队列（TCGA-BLCA和GSE32894）中的预后价值。此外，我们进行了功能分析、免疫效应评估、遗传突变图谱探索和单细胞分析，以更全面地理解LRG评分的意义。本研究为BLCA的诊断和治疗提供了关键的见解。
1 方法
1.1 数据来源
使用“TCGAbiolinks”包[14]下载TCGA数据库中412个BLCA样本和19个正常组织样本的RNA-Seq和相关临床数据，以及BLCA的体细胞突变图谱。此外，总生存期（OS）、无病生存期（DFI）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFI）等生存结果数据从UCSC Xena网站（https://xena.ucsc.edu）下载。GSE13507和GSE32894来自基因表达综合数据库（GEO数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），一共包含473个BLCA样本和93个正常组织样本。从AmiGO2（http://amigo.geneontology.org/amigo）中获取875个LRGs。此外，还从GEO数据库中获取BLCA的单细胞数据集GSE222315。使用R（4.2.0）进行数据处理。
1.2 差异基因
使用“edgeR”包[15]识别上述三个数据集中BLCA样本和正常组织中差异表达的基因（P＜0.05，差异倍数大于1.2）。然后将差异基因和LRG取交集获得差异表达的LRGs。使用“ggplot2”包和“heatmap”包绘制热图和火山图。
1.3 基因功能分析
使用“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”进行富集分析，P＜0.05被认为具有显著性，并通过“ggplot2”包进行可视化。
1.4 构建和验证LRG评分
为了识别与预后相关的候选基因，首先进行单变量Cox回归分析，并选择P＜0.05的基因作为候选基因。接着，使用Lasso回归排除共线性基因，得到9个候选基因。然后，利用随机森林评估由单变量Cox回归识别的27个基因的重要性，选取前10个重要的基因。将由Lasso回归和随机森林获得的基因取交集，得到7个基因进行多变量Cox回归分析，最终筛选5个关键基因，结合每个关键基因的回归系数构建LRG评分公式。随后使用公式计算每个患者的LRG评分 = COL6A1_exp * 0.139293564057873 + CTSV_exp*0.11580732005826+GPC2_exp*（-0.265731063644488）+GZMH_exp*（-0.263010874358063）+LRP1_exp*（0.265257370058615）。使用“survival”，“survminer”，“ggplot2”包进行Kaplan-Meier生存分析和时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线分析。
1.5 构建和验证列线图
为了预测患者1~5年的生存率，使用“survival”和“regplot”包构建列线图。通过使用“rms”包获取校准曲线来评估列线图的准确性。使用时间依赖性ROC曲线分析衡量列线图的性能。
1.6 LRG评分富集分析
为了探索与LRG评分组相关的生物学功能和通路，使用“clusterProfiler”和“ReactomePA”包进行基因集富集分析（GSEA），以用于基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和Reactome分析。使用“GSVA”、“msigdbr”、“limma”和“ggplot2”包进行基因集变异分析（GSVA）[16]，并可视化不同LRG评分组激活的通路。
1.7 免疫学特征评估
为了评估TCGA数据库中BLCA患者的免疫浸润情况，利用“CIBERSORT”包[17]分析不同LRG评分组之间免疫细胞浸润的差异。使用“ggplot2”包生成堆叠条形图和箱线图。然后，使用“psych”包计算COL6A1、CTSV、GPC2、GZMH、LRP1和LRG评分与免疫细胞的相关性。此外，调查不同LRG评分组之间免疫检查点基因表达的差异。最后，利用Tumor Immune Dysfunction and Exclusion（TIDE）算法（http://tide.dfci.harvard.edu/）预测不同LRG评分组患者对免疫治疗的响应。
1.8 单细胞RNA测序分析
使用“Seurat”包[18]分析单细胞测序数据集。保留符合以下标准的细胞：线粒体基因占比少于6%，基因表达范围为200~6 000，细胞总体基因数最高值为20 000。将高度可变基因的数量限制在4 000个以内。接着，对所有样本进行归一化处理，去除批次效应，并通过SCT进行整合。将PCA的20个维度带入UMAP，构建二维模型。细胞聚类采用SNN算法，分辨率参数设置为0.4。主要细胞类型通过以下标记物识别：上皮细胞（EPCAM、KRT7、KRT13、UPK1B、UPK1A、CDH1），T细胞（CD3D、CD3E、CD8B、CD8A、IL7R），巨噬细胞（C1QA、C1QB、APOE、SPP1），单核细胞（FCNA、VCAN、LYZ、AIF1），肥大细胞（TPSB2、TPSAB1、CPA3、KIT），NK细胞（NKG7、GNLY、GZNB、KLRD1），B细胞（CD79A、MS4A1、IGHG3、MZB1），内皮细胞（PECAM1、VWF、CDH5、PLVAP、RAMP2），成纤维细胞（COL1A1、COL1A2、POSTN、DCN、LUM）。此外，使用“irGSEA”和“UCell”[19]包对与不同细胞类型相关的通路进行富集分析，并将其可视化为热图。
2 结果
2.1 BLCA中与溶酶体相关预后基因评分的识别和构建
首先对TCGA-BLCA、GSE13507和GSE32894三个数据集进行合并，一共得到885个BLCA样本，112个正常样本，并对其进行差异分析后得到差异表达基因（DEGs）（图1（a））。然后将DEGs与LRG集取交集，获得46个溶酶体相关DEGs（图1（b））。溶酶体相关DEGs的富集分析结果显示，大部分基因富集于免疫相关（系统性红斑狼疮、肠道免疫网络负责IgA的产生、类风湿性关节炎等）和细胞外基质相关（含胶原的细胞外基质、细胞外基质结构成分等）通路（图1（c），1（d））。接着，对溶酶体相关DEGs使用单因素Cox回归分析，得到27个P＜0.05且与生存相关的显著基因（图1（e））。为了识别核心的溶酶体相关预后基因，采用两种不同的机器学习算法，即LASSO回归和随机森林算法。使用LASSO回归进一步筛选得到9个基因（COL6A1、CSPG4、CTSV、EPDR1、GPC2、GZMH、HOOK1、LRP1、PRELP）（图1（g），1（h））。此外，利用随机森林算法，选择前10个最重要基因（图1（f））。通过LASSO回归和随机森林算法过滤出的与溶酶体相关预后基因的交集，识别出7个候选基因（COL6A1、CTSV、EPDR1、GPC2、GZMH、LRP1、PRELP（图1（i））。最后为了提高生存分析的准确性和稳健性，对这7个候选基因采用多因素Cox回归分析，最后获得5个基因（COL6A1、CTSV、GPC2、GZMH、LRP1）用于构建LRG评分。
图1LRG的鉴定及LRG评分的开发
Fig.1Identification of LRG and development of the LRG score
注：（a）BLCA样本与正常样本之间的DEGs的火山图；（b）46个溶酶体相关DEGs的热图;（c）溶酶体相关DEGs的GO富集分析;（d）溶酶体相关DEGs的KEGG富集分析；（e）单因素Cox分析得到的生存相关基因的森林图;（f）随机森林算法将溶酶体相关基因按重要性排序;（g）27个危险因素的Lasso系数路径图;（h）交叉验证曲线;（i）Lasso和随机森林的交集.
2.2 验证LRG评分的预后价值
在构建LRG评分后，进行评估和验证分析。根据LRG评分的中位数将患者分为高分组和低分组。在整个TCGA-BLCA数据集中绘制了OS、DSS、DFI和PFI的生存曲线，发现高分组患者在四个生存指标中均具有更低的生存率，特别是高分组患者具有更短的DFI（图2（a）~2（d））。随后，随机筛选70%的TCGA-BLCA数据集作为训练集，其余30%作为内部验证集，GSE32894作为外部验证集。在上述三组数据集中进行生存分析，同样发现高分组患者的预后较差，特别是在TCGA-BLCA验证集中，高分组患者同时具有较短的生存时间（图2（e）~2（g））。接着，应用时间依赖的ROC曲线分析评估LRG评分的预测能力。众所周知，ROC曲线越靠近左上角，模型的性能越好[20]。AUC值是ROC曲线下的面积，其取值范围在0.5~1.0之间。AUC值越大，也说明模型的性能越好[20]。在TCGA-BLCA全集、训练集以及两组验证集中1~5年的AUC均大于0.6，部分大于0.7（图2（h）~2（k）），说明LRG评分具有较好的预测性能，能够较为准确地将生存期较长和较短的患者区分开，这为LRG评分的进一步研究奠定了基础。
2.3 列线图的建立与评估
为了使LRG评分在临床实践中得到更好的应用，基于TCGA-BLCA队列中的性别、年龄、分级和LRG评分创建了一个列线图（图3（a））。从列线图可见，分级和LRG评分对预测生存概率做出了巨大贡献。如校准曲线所示，预测的1年OS与实际的OS非常接近，表明列线图在临床应用中具有很高的可靠性和价值（图3（b））。然后，通过比较列线图、LRG评分和常见临床病理特征在不同时间点的AUC值，以评估列线图的预测性能。结果显示，LRG评分和列线图ROC曲线的1~5年AUC值均大于0.6和0.7，高于其他单一独立临床指标ROC曲线的AUC值，说明他们具有更准确的预测性能和判别力（图3（c）~3（g））。综上所述，这些结果表明本研究的LRG评分在临床决策中具有实用性和影响力，并适合作为临床环境中预测BLCA患者预后的临床决策工具。
图2验证LRG评分的预后价值
Fig.2Validation of the prognostic value of the LRG score
注：（a）基于TCGA-BLCA全集的OS生存曲线;（b）基于TCGA-BLCA全集的DSS生存曲线；（c）基于TCGA-BLCA全集的DFI生存曲线;（d）基于TCGA-BLCA全集的PFI生存曲线；（e）TCGA-BLCA训练集中LRG评分的生存分析；（f）TCGA-BLCA验证集中LRG评分的生存分析；（g）GSE32894验证集中LRG评分的生存分析；（h）TCGA-BLCA全集中1~5年生存预测的时间依赖性ROC曲线;（i）TCGA-BLCA训练集中1~5年生存预测的时间依赖性ROC曲线；（j）TCGA-BLCA验证集中1~5年生存预测的时间依赖性ROC曲线（k）GSE32894验证集中1~5年生存预测的时间依赖性ROC曲线.
图3临床病理相关性和列线图构建
Fig.3Clinical pathological correlations and nomogram construction
注：（a）用于预测1~5年总体生存概率的列线图;（b）列线图的校准曲线;（c）不同指标在1年时诊断准确性的ROC曲线;（d）不同指标在2年时诊断准确性的ROC曲线;（e）不同指标在3年时诊断准确性的ROC曲线;（f）不同指标在4年时诊断准确性的ROC曲线;（g）不同指标在5年时诊断准确性的ROC曲线.
2.4 生物功能和通路分析
为了探索不同评分组中潜在的分子特征，进行GO术语、KEGG通路和Reactome通路分析，通过GSEA评估潜在的生物功能。GSEA结果显示，富集的GO术语大多与构成细胞外基质（ECM）成分和结构的通路相关，如胶原蛋白三聚体复合物、赋予细胞外基质拉伸强度的结构成分、纤连蛋白结合等（图4（a））。KEGG通路富集在药物耐药性和药物代谢等方面（图4（b））。基于Reactome数据集的GSEA结果显示，大部分富集在与胶原蛋白和ECM合成相关的通路中（图4（c））。此外，对高分组和低分组进行GSVA功能富集分析，以进一步识别显著富集的激活通路。KEGG通路、GO功能和50个hallmark基因集的GSVA结果也表明，ECM形成、细胞与ECM相互作用、细胞骨架重组和细胞黏附，如粘着斑、肌动蛋白细胞骨架的调控、细胞连接装配、基质依赖性细胞迁移和TGF-β信号传导等在高分组中富集（图4（d）~4（f））。这些结果表明，LRG评分可能与ECM重塑有关，并影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。
图4不同LRG评分组的富集分析
Fig.4Enrichment analysis of different LRG score groups
注：（a）通过GSEA进行的GO富集分析；（b）通过GSEA进行的KEGG富集分析；（c）通过GSEA进行的Reactome富集分析；（d）基于KEGG途径的GSVA富集分析；（e）基于GO功能的GSVA富集分析;（f）基于hallmark基因集的GSVA富集分析.
2.5 不同评分组的肿瘤免疫微环境景观
肿瘤进展受到微环境细胞和肿瘤细胞之间复杂相互作用的强烈影响。肿瘤微环境由肿瘤细胞和多样化的免疫细胞群体组成。为了确定LRG评分与免疫反应之间的关联，使用CIBERSORT算法估算每个样本中免疫细胞的比例（图5（a））。然后，进一步计算高分组和低分组之间免疫细胞的差异（图5（b））。高分组显示出了更高的M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息的肥大细胞、中性粒细胞和静息的记忆CD4+T细胞浸润。然而，低分组具有更多的浆细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞浸润。随后，计算LRG评分，COL6A1、CTSV、GPC2、GZMH和LRP1与不同免疫细胞之间的相关性（图5（c））。结果显示，GZMH与CD8+T细胞和M1巨噬细胞呈正相关，而LRG评、COL6A1、CTSV、GPC2和LRP1与大多数免疫细胞没有十分显著的关联。这些结果表明，低分组中抗肿瘤免疫细胞的浸润程度更高，而高分组中抗肿瘤和抑肿瘤免疫细胞均有较高的浸润程度，进一步的相关性分析提示高分组可能与肿瘤微环境中的非免疫细胞相关。
2.6 LRG评分与免疫检查点和突变负荷的关联
免疫检查点调节剂在免疫细胞与癌细胞之间发挥着关键作用。据报道，免疫检查点阻断相关基因的表达水平与免疫检查点抑制剂的治疗反应有关[21]。我们分析了这些免疫检查点基因在不同评分组的分布情况。结果显示，许多基因（如CD209、CD276、CD86、LGALS9、SIRPA和TNFSF9等）在两个不同评分组中存在统计学上的显著差异（图6（a））。为了评估高分组和低分组中免疫治疗的潜在临床效果，使用了TIDE算法。分析结果显示，低分组患者对免疫治疗的响应率较高（图6b），且高分组患者的TIDE评分和Exclusion评分较高（图6（c）、6（d）），表明低分组患者更能从免疫检查点抑制剂治疗中获益，而高分组患者的免疫治疗效果较差，可能需要考虑其他治疗方案，如传统的化疗或靶向治疗等。接着，分析了高分组和低分组的突变情况，分别展示了两组中突变频率最高的前10个基因（图6（e）、6（f））。两组中突变频率最高的基因都是TP53。此外，许多基因在低分组中的突变率明显高于高分组（图6（g）），表明低分组患者受体细胞突变的影响更大。这些发现强烈提示LRG评分与免疫检查点和体细胞突变相关。
图5不同评分组的肿瘤免疫微环境分析
Fig.5Analysis of the tumor immune microenvironment across different score groups
注：（a）TCGA-BLCA队列中免疫细胞的丰度比率；（b）低分组和高分组之间免疫细胞浸润差异;（c）评分基因和LRG评分与浸润的免疫细胞之间相关性.
图6LRG评分与免疫治疗以及突变负荷之间的关联
Fig.6Association between the LRG score and immunotherapy as well as mutation burden
注：（a）高分组和低分组之间免疫检查点基因的差异表达;（b）不同组中对免疫治疗的响应率;（c）不同组之间TIDE评分的差异;（d）不同组之间Exclusion评分的差异;（e）高分组的突变分析;（f）低分组的突变分析;（g）不同组之间突变显著不同的突变基因.
2.7 单细胞测序数据中细胞的定位和通路的富集分析
为了研究5种建模基因和LRG评分在各种细胞类型中的表达，我们进行了单细胞测序分析。首先获取了BLCA的单细胞测序数据集GSE222315，整合不同的样本并去除批次效应后，使用SNN算法将所有细胞分为41个簇。根据不同细胞类型表面标记物的表达，识别出9种不同的细胞类型（图7（a））。特征图和小提琴图展示了COL6A1、CTSV、GPC2、GZMH和LRP1在不同细胞中的表达情况，发现COL6A1在成纤维细胞中高表达，GZMH在NK细胞中高表达（图7（b）~7（g））。此外，我们发现大部分成纤维细胞具有更高的LRG评分，而大部分B细胞和NK细胞具有更低的LRG评分（图7（h），7（i）），这意味着高LRG评分可能影响成纤维细胞。单细胞数据的通路富集分析显示，成纤维细胞中上调了TGF-β信号传导和上皮-间质转化（图7（j））。这一结果进一步表明，LRG评分可能通过成纤维细胞参与ECM重塑相关进程来影响肿瘤生长。
3 讨论
BLCA是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，大多数起源于尿路上皮[5]，其高复发率和不良预后是临床研究的难点。因此，开发新方法来评估BLCA患者的预后具有重要价值。长期以来，溶酶体作为癌症治疗的潜在靶点一直备受关注[22-23]。然而，溶酶体相关基因在BLCA诊断和治疗中的临床相关性尚未完全阐明。在本研究中，我们采用了差异表达分析和单变量Cox回归分析，以确定差异表达且与生存相关的LRG。然后，我们利用机器学习方法基于这些基因开发了一个LRG评分。我们选择了Lasso回归算法，但当基因之间存在高度相关性时，它可能不会总是选择最相关的预测因子[24]。于是，我们同时采用了随机森林方法来识别最重要的基因[25]。借助两种机器学习算法，我们成功识别了5个关键的LRGs。然而，过拟合是生物医学模型开发中机器学习常见的问题[26]。因此，我们采用多变量Cox回归来推导最终的LRG评分，减少了生存模型中的过拟合，并增强了其稳定性、精确性和可信度。Kaplan-Meier分析和ROC曲线结果证实LRG评分可以可靠地预测BLCA患者在训练集和验证集中的预后情况。
为了更深入地理解低分组和高分组之间复杂的生物学相互作用，我们基于多个数据库采用了GSEA和GSVA方法。GSEA和GSVA结果揭示了LRG评分显著影响ECM重塑相关过程。然而，使用bulk RNA-seq在总体表达水平上揭示转录组异质性，这导致无法解析不同细胞类型的作用[27]。scRNA-seq技术已成为评估单个细胞水平基因表达不可或缺的工具，能够深入理解细胞异质性并更准确地表征细胞类型[27]。为了确定先前提及的途径分析影响何种细胞类型，我们进行了scRNA-seq分析。单细胞研究揭示COL6A1在成纤维细胞中高表达，且大部分成纤维细胞具有更高的LRG评分。单细胞水平的GSEA结果显示，成纤维细胞显著上调了TGF-β信号传导。
图7单细胞测序数据中细胞分布和富集通路的研究
Fig.7Investigation of cell distribution and enriched pathways in single-cell sequencing data
注：（a）所有细胞的UMAP图;（b）COL6A1的表达情况;（c）CSTV的表达情况;（d）GPC2的表达情况;（e）GZMH的表达情况;（f）LRP1的表达情况;（g）各个基因在不同细胞类型中的表达情况;（h）高分组和低分组的分布情况;（i）高分组和低分组中各细胞类型占比情况;（j）单细胞水平的通路富集分析.
有研究表明，驻留的正常成纤维细胞可以通过TGF-β1在包括BLCA在内的各种肿瘤中转化为癌症相关成纤维细胞（CAF）[28-30]。ECM是肿瘤微环境（TME）中的主要成分。ECM的组成、生化和机械特性控制着肿瘤细胞的分化、增殖、迁移和侵袭。在肿瘤发展和进展的过程中，ECM都经历着活跃和持续的重塑[31]。已有研究表明，CAFs的生成、招募和激活会导致ECM的重塑，并促进肿瘤发生[32-34]。在BLCA中已鉴定出一组CAF亚群，并显示出与ECM相关基因和TGF-β的高表达，表明该CAF亚群可能调控ECM的重塑[35]。总的来说，组织和细胞水平的分析均表明，LRG评分显著影响了ECM重塑，并可能通过CAF影响肿瘤进展。
TME的特征在肿瘤成功生长和转移中起着关键作用[36]。作为TME的重要组成部分，免疫细胞浸润已被证明对肿瘤进展和免疫治疗的有效性有显著影响[37]。因此，我们进行了研究，以确定低分组和高分组之间免疫细胞浸润水平的差异。结果表明，高分组中的浆细胞和CD8+T细胞浸润率低于低分组。先前的研究表明，肿瘤相关三级淋巴结构与BLCA患者更好的生存率和免疫反应有关，而浆细胞是肿瘤相关三级淋巴结构中B细胞的关键细胞群[38-40]。CD8+T细胞作为各种免疫相关调节过程的主要执行者，它在癌症病变中的浸润与包括BLCA在内的几种恶性肿瘤的更好预后相关[41-42]。此外，使用TIDE算法的分析显示，与高分组相比，低分组患者从免疫治疗中获益的可能性要大得多。总之，我们的发现表明，低分组的患者可能更有可能对免疫治疗产生良好的反应。
本研究存在几个局限性。首先，我们的预后模型是使用从公共数据库获取的回顾性数据构建和验证的。尽管我们的结果显示LRG评分在预测BLCA预后方面的潜在效用，但需要额外的前瞻性数据来全面确立其临床意义。此外，由于实验条件受限，我们的研究结果尚未通过实验手段进行探索，未来将致力于进一步的实验验证。
4 总结
总之，本研究通过构建基于溶酶体相关基因的预后模型，揭示了LRG评分在BLCA预后预测、ECM重塑、肿瘤微环境调控及免疫治疗反应中的重要作用，为BLCA的精准治疗提供了新的理论依据。
