摘要
通过转录组分析刻画肺鳞癌中视黄酸诱导基因样受体 (Retinoic acid-inducible gene-like receptor，RLRs) 家族的表达模式，结合PPI网络(Protein-Protein interaction network，PPI)和共表达分析筛选RLRs家族关键互作基因，探究RLRs家族基因表达与免疫分子和免疫细胞浸润的相关性，基于非小细胞肺癌免疫治疗数据探讨RLRs对于免疫耐受的影响，助力肺鳞癌免疫调控机制的研究。对下载的肺鳞癌mRNA表达数据，通过秩和检验方法探索RLRs家族成员在肺鳞癌中的表达差异，刻画其在不同癌症阶段的表达模式。进一步计算RLRs家族成员与互作基因的皮尔森相关性，识别显著互作基因进行富集分析。结合免疫调控和免疫细胞浸润数据，分析肺鳞癌中RLRs家族成员与三种免疫调节剂以及免疫细胞浸润的相关性。最后利用TIDE方法评估RLRs基因家族对于肺鳞癌患者免疫治疗受益性的影响，并通过COX回归验证RLRs家族成员的基因表达和肺鳞癌免疫治疗预后的关系。秩和检验发现RLRs家族成员在肺鳞癌的癌症患者中表达下调，且DHX58在肺鳞癌不同阶段随着分期表达下降。功能富集结果表明RLRs基因家族成员主要参与抗病毒的防御反应等生物学过程。免疫调控分析显示RLRs家族成员与MHC分子，免疫抑制剂，免疫刺激剂显著正相关，并且与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的浸润均呈现正相关。RLRs基因能够影响肺鳞癌患者对于免疫治疗的受益程度，并且DDX58的高表达水平与免疫治疗患者较好预后相关。本研究揭示了RLRs家族成员在肺鳞癌中的表达失调，RLRs家族与肿瘤免疫微环境以及免疫治疗相关，DDX58有成为肺鳞癌预后分子标志物的潜力。
Abstract
The expression pattern of the retinoic acid inducible gene like receptor family (RLRs) in lung squamous cell carcinoma is characterized through transcriptome analysis. This is complemented with Protein-Protein Interaction Network (PPI) and co-expression analysis to identify RLRs family related interaction genes. This study also aims to explore the correlation between RLRs family gene expression, immune molecule and immune cell infiltration, as well as to investigate the impact of RLRs on immune tolerance based on immunotherapy data of non-small cell lung cancer. These findings are expected to contribute to the understanding of immune regulatory mechanisms in lung squamous cell carcinoma.The differential expression of RLRs family members in lung squamous cell carcinoma is explored using the rank sum test method on downloaded mRNA expression data, and their expression patterns at different stages of cancer are characterized. Furthermore, the Pearson correlation between RLRs family members and interacting genes is calculated, and significant interacting genes are identified for enrichment analysis. The correlation between RLR family members and three immune modulators, as well as immune cell infiltration in lung squamous cell carcinoma, is analyzed by combining data on immune regulation and immune cell infiltration. Finally, the impact of the RLRs gene family on immunotherapy benefit in patients with lung squamous cell carcinoma is evaluated using the TIDE method, and the relationship between gene expression of RLRs family members and the prognosis of immunotherapy in lung squamous cell carcinoma is verified using COX regression.The rank sum test revealed that members of the RLRs family are downregulated in cancer patients with lung squamous cell carcinoma, and the DHX58 expression decreased with disease staging at different stages of lung squamous cell carcinoma. The functional enrichment results indicate that members of the RLRs gene family are mainly involved in biological processes such as antiviral defense responses. The immunoregulatory analysis shows that members of the RLRs family are significantly positively correlated with MHC molecules, immunosuppressants, and immunostimulants, and positively correlated with the infiltration of B cells, CD8+T cells, CD4+T cells, macrophages, and neutrophils. It is found that the RLRs gene can be affected by the degree of benefit of immunotherapy in lung squamous cell carcinoma patients, and that a higher expression level of DDX58 is associated with a better prognosis in immunotherapy patients. This study reveals that the expression of RLRs family members are dysregulated in lung squamous cell carcinoma. The RLRs family is associated with the tumor immune microenvironment and immunotherapy, and DDX58 has the potential to be a prognostic molecular marker for lung squamous cell carcinoma.
Keywords
肺癌是全球范围内发病率和病死率均居首位的癌症[1]。临床上根据癌细胞的类型不同将原发性肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。在我国，非小细胞肺癌约占所有肺癌总数的85%，包括肺鳞癌和肺腺癌，其中肺鳞癌又称肺鳞状细胞癌（Lung squamous cell carcinoma，LUSC），与吸烟密切相关，是导致我国居民死亡的主要原因之一[2]。目前肺鳞癌的主流治疗手段仍是手术，切除辅以术后放化疗是唯一可以达到根治目的的治疗方式。因此，发现肺鳞癌潜在的诊断标志物及治疗靶点具有重要临床意义。
近年来，随着对固有免疫研究的深入，模式识别受体家族的相关研究不断涌现。RLRs（视黄酸诱导基因样受体家族）是重要的外源核酸传感器，可识别病毒复制过程中产生的双链RNA发挥抗病毒作用[3]。RLRs属于DEx D/H盒子RNA解旋酶，由视黄酸诱导基因1（Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I/DDX58）、黑色素瘤分化相关基因5（Melanoma differentiation-associated gene5，MDA5/ IFIH1）、遗传与生理实验分子（Laboratory of genetics and physiology 2，LGP2/ DHX58）组成，其主要功能是识别病毒RNA激活干扰素信号通路，进而启动抗病毒免疫反应[4-5]。虽然目前RLRs基因家族在抗病毒免疫反应的研究已经有一定进展，但还缺少在肺鳞癌上表达模式的刻画、免疫调控、免疫治疗等相关方面的研究及成果。
因此，本研究旨在通过多种生物信息学分析方法探究RLRs家族在肺鳞癌中的表达模式、相关通路及功能、免疫调控、生存预后等，为肺鳞癌的诊断和治疗提供新的思路。
1 材料和方法
1.1 材料与处理
1.1.1 肺鳞癌表达谱数据
mRNA表达数据由TCGA数据库获取，利用其中的501例肺鳞癌样本和49例配对的正常样本对RLRs基因家族成员进行差异表达分析。从GEO数据库[6]下载非小细胞肺癌的免疫治疗数据（编号GSE161537），选择其中的82例癌症样本进行分析。
1.1.2 免疫治疗受益性结果的获取
首先将癌症样本的表达减去癌旁样本表达的均值，再把获得标准化处理后的数据投到TIDE数据库[7]中，获取肺鳞癌样本对免疫治疗的受益性分析结果。其中选取对免疫治疗是否受益（NO_benefits）和对免疫治疗是否有反应（Responder）两个维度的结果对RLRs家族成员的样本进行（TRUE和FALSE）分组，通过秩和检验评估两组之间的表达差异。
1.1.3 RLRs家族相关互作基因的获取
STRING数据库是一个可获取已知蛋白之间互作关系（Protein-protein interaction，PPI）的数据库[8]。在此平台上检索RLRs家族的蛋白互作基因，筛选并获取RLRs基因家族的相关互作基因集合，用于分析基因表达之间的皮尔森相关性。
1.2 实验方法
1.2.1 RLRs家族在不同肺鳞癌阶段的差异表达分析
GEPIA2数据库是一个结合了TCGA与GTEX数据库资源的公共分析平台[9]。通过该平台的Expression DIY功能中的Stage Plot模块探究 RLRs基因家族成员之间不同癌症阶段的差异性表达。
1.2.2 富集分析
Metascape数据库是一个强大的基因功能注释分析工具[10]。在进行皮尔森相关性筛选显著互作基因后，使用该数据库对基因进行功能富集分析，识别关键互作基因所参与的生物学通路。
1.2.3 免疫调控分析
TISIDB数据库是一个通过整合研究文献和多种类型的高通量数据来构建的肿瘤-免疫相互作用的数据库[11]。本研究借助该平台来分析肺鳞癌中RLRs基因家族成员的基因表达以及三种免疫调节剂（Immunostimulatory molecules，immunosuppressive molecules，MHC molecules）之间的相关性。
1.2.4 免疫浸润分析
TIMER2.0数据库是一个基于TCGA等公共数据资源的综合性分析平台[12]。它提供常见癌症中基因表达差异和免疫细胞浸润的相关性分析。在本研究中，利用该平台的“免疫关联”模块，分析RLRs基因家族成员的基因表达和不同免疫细胞（B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞）之间的相关性。
1.2.5 预后分析
利用GEO数据库下载的非小细胞肺癌数据，根据RLRs家族成员在癌症样本中的表达中值，将样本分成高表达组和低表达组。结合R程序包survival和survminer进行COX回归分析[13]，刻画RLRs家族与免疫治疗预后的相关性。
2 结果
2.1 RLRs家族在肺鳞癌中的表达模式
对从TCGA数据库下载的肺鳞癌样本表达数据进行秩和检验，发现DDX58，DHX58，IFIH1在正常样本中的mRNA表达显著高于癌症样本中的表达（图1（a））。接着通过GEPIA2比较DDX58，DHX58，IFIH1在肺鳞癌不同的癌症阶段表达差异，发现DHX58基因在不同肺鳞癌阶段的表达存在着显著差异（图1（b））。
图1肺鳞癌中RLRs家族的表达模式分析
Fig.1Analysis of the expression pattern of the RLRs family in lung squamous carcinoma
注：（a）RLRs家族成员在肺鳞癌样本和癌旁中的表达对比；（b）不同肺鳞癌阶段的表达对比.
2.2 RLRs家族相关分子的功能和通路富集分析
为了进一步探究RLRs基因家族及其相关互作基因的功能。通过STRING数据库检索出11条RLRs家族的蛋白互作关系，并绘制RLRs基因家族相关PPI网络（图2（a））。结合共表达分析，以|cor|＞0.3，FDR＜0.05进行筛选，识别出10个显著共表达基因。接着使用Metascape数据库对显著共表达基因进行功能富集分析，发现主要富集在对病毒的防御反应，干扰素信号，病毒基因组复制的负调控等生物学通路中（图2（b））。
图2RLRs家族PPI网络及富集分析
Fig.2PPI network and enrichment analysis of the RLRs famil
注：（a）RLRs家族PPI网络;（b）显著互作基因功能富集分析.
2.3 RLRs家族的免疫调控分析
肿瘤中的免疫细胞浸润是肿瘤微环境不可或缺的组成部分，也是反映预后和淋巴转移状态的独立指标。因此首先通过TISIDB数据库研究肺鳞癌中RLRs家族成员与免疫调节剂之间的关系。结果显示RLRs家族成员与MHC分子，免疫抑制剂，免疫刺激剂的相关性高度一致，RLRs家族成员的表达与MHC分子，免疫抑制剂，免疫刺激剂显著正相关（图3（a）。接着通过TIMER2.0数据库分析肿瘤免疫细胞浸润与RLRs家族各成员之间的相关性，发现RLRs家族成员与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及树突细胞的浸润均呈现正相关，表明其在肺鳞癌免疫细胞浸润的机制中发挥重要的作用（图3（b））。
2.4 RLRs家族免疫治疗受益程度及预后分析
结合前面研究发现RLRs家族成员与免疫调控存在显著相关性，因此进一步评估RLRs家族与免疫治疗的关联。通过TIDE算法和秩和检验分析，RLRs家族对免疫治疗是否受益和对免疫治疗是否有反应两个维度的表达差异。结果显示，RLRs家族成员在免疫治疗受益（No_benefits，FALSE）的样本中高表达，在免疫治疗不受益（No_benefits，TRUE）的样本中低表达（图4（a））。对免疫治疗反应（Responder，TRUE）的样本中高表达，对免疫治疗无反应（Responder，FALSE）的样本中低表达（图4（a），提示RLRs家族成员对免疫治疗存在积极作用。结合非小细胞肺癌免疫数据GSE161537，通过单因素COX回归分析发现RLRs家族成员中，DHX58与患者预后不相关，IFIH1在芯片数据中没有被捕获，DDX58的低表达与患者较差的免疫治疗预后相关，提示它可能是新的肺鳞癌免疫治疗靶点（图4（b））。
图3RLRs家族免疫调控分析
Fig.3Analysis of immunoregulation of the RLRs family
注：（a）RLRs家族与三种免疫调节剂相关性热图;（b）RLRs家族与免疫细胞相关性热图.
3 讨论
在本研究中，对RLRs家族成员在肺鳞癌中差异表达分析发现DDX58，DHX58，IFIH1的表达在正常样本中显著升高，且DHX58在肺鳞癌不同阶段中存在着更显著的差异性。在富集分析中发现RLRs家族成员还与病毒相关。有研究表明多种病毒可以激活RLRs，如登革病毒（Dengue virus）、肠道病毒EV71型（Enterovirus 71）和寨卡病毒（Zika virus）等[14-16]。而RLRs家族成员中如IFIH1主要识别小RNA病毒的感染，如脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒等[17]。DDX58则可以用作抗病毒药物靶点研究。
图4RLRs家族免疫受益及预后分析
Fig.4Analysis of Immunotherapy Benefit and Prognosis for Families of RLRs
注：（a）RLRs家族在免疫治疗受益与免疫治疗有反应两组中的表达差异，TRUE表示对免疫治疗不受益和对免疫治疗有反应，FALSE表达对免疫治疗受益及对免疫治疗无反应;（b）DDX58高低表达组的生存曲线.
通过研究RLRs家族在免疫调控方面的作用，发现RLRs家族的表达与多种免疫调节剂和免疫细胞浸润呈现显著正相关，提示其在肿瘤免疫浸润过程中发挥重要作用。也有研究表明，DDX58刺激剂已被证实是癌症治疗中的免疫药物，并可通过多种方式诱导肿瘤细胞凋亡[18-19]。在协同免疫检查点抑制剂方面，5′ppp-RNA通过DDX58诱导细胞毒性T细胞的交叉启动及抗肿瘤免疫依赖于宿主转接器蛋白MAVS和Ⅰ型干扰素（IFNⅠ）信号，协同CTLA-4抗体阻断诱导抗原特异性CD8+T细胞的扩增和活化，增强抗肿瘤免疫[20]。这些研究表明DDX58在肿瘤免疫过程中会发挥重要作用。结合TIDE算法分析发现RLRs家族在免疫治疗方面十分受益，并利用非小细胞肺癌抗PD-1治疗数据分析发现了DDX58的高表达与患者较差的免疫治疗预后相关，提示其可能是一个新的肺鳞癌免疫治疗靶点，可通过相关生物学实验进一步验证其在肺鳞癌免疫治疗中的预后价值。
4 结论
通过生物信息学方法探索RLRs家族在肺鳞癌中的表达模式，解析其与免疫调控的关联，最终识别到了潜在预后靶点DDX58，为研究肺鳞癌的发生发展和寻找肿瘤诊断标志物提供了新见解。
