斑马鱼急性无机砷暴露后肝脏差异表达基因的生物信息学分析

引用本文

张新生, 张越, 孙纳. 斑马鱼急性无机砷暴露后肝脏差异表达基因的生物信息学分析[J]. 生物信息学, 2024, 22(1): 70-78. DOI: 10.12113/202208014.

ZHANG Xinsheng, ZHANG Yue, SUN Na. Bioinformatics analysis of differentially expressed genes in zebrafish liver after acute exposure to inorganic arsenic[J]. Chinese Journal of Bioinformatics, 2024, 22(1): 70-78. DOI: 10.12113/202208014.

基金项目

国家自然科学基金项目(No.81070128)；沈阳市“高层次创新人才计划”项目(No.RC170408)；沈阳医学院硕士研究生科研创新基金项目(No.Y20190501)；辽宁省重点研发计划项目(No.2018225013)；沈阳中青年高层次人才创新支持计划项目(No.RC180379)

通信作者

孙纳，男，主任医师，研究方向：职业卫生与放射卫生学.E-mail：31779031@qq.com

文章历史

收稿日期: 2022-08-22

修回日期: 2023-03-15

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

斑马鱼急性无机砷暴露后肝脏差异表达基因的生物信息学分析

张新生 ¹, 张越 ², 孙纳 ¹

1. 无锡市疾病预防控制中心职业与放射卫生科，江苏，无锡 214000;
2. 沈阳医学院职业卫生科，沈阳 110000

收稿日期: 2022-08-22; 修改日期: 2023-03-15; 网络首发日期: 2023-06-02

基金项目: 国家自然科学基金项目(No.81070128)；沈阳市“高层次创新人才计划”项目(No.RC170408)；沈阳医学院硕士研究生科研创新基金项目(No.Y20190501)；辽宁省重点研发计划项目(No.2018225013)；沈阳中青年高层次人才创新支持计划项目(No.RC180379)

通信作者: 孙纳，男，主任医师，研究方向：职业卫生与放射卫生学.E-mail：31779031@qq.com

摘要: 砷是一种致癌物，是心血管、外周血管疾病、神经疾病、糖尿病和各种癌症的致病因素。目的：利用GO数据库和KEGG数据库等生物信息学方法对GEO数据库数据中的差异表达基因进行评价。利用生物信息学分析软件对差异基因进行功能富集、功能注释分析和生存分析。利用Cytoscape上的蛋白-蛋白相互作用网络(Protein-protein interaction network, PPI)软件对179个差异基因进行筛选和分析。结果发现126个基因作用于蛋白靶点，其中有10个基因为关键基因分别为：PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9H和TCP1。核心基因主要作用于内质网中的蛋白质加工通路。这可能会为砷对肝脏损伤的潜在生物标志物和生物学机制提供新的思路。

关键词: 生物信息学微阵列砷差异表达基因

Bioinformatics analysis of differentially expressed genes in zebrafish liver after acute exposure to inorganic arsenic

ZHANG Xinsheng ¹, ZHANG Yue ², SUN Na ¹

1. Occupational and Radiological Health Department of Wuxi Center for Disease Control and Prevention, Wux 214000, Jiangsu, China;
2. Department of Occupational Health, Shenyang Medical College, Shenyang 110000, China

Abstract: Arsenic is a carcinogen and a causative agent of cardiovascular and peripheral vascular disease, neurological disorders, diabetes mellitus and various forms of cancer. Objective: Used Bioinformatics methods such as GO database and KEGG database to evaluate the differentially expressed genes in GEO database data. Methods: Functional enrichment, functional annotation analysis and survival analysis of the differential genes were performed by using bioinformatics analysis software. Results: Used protein-protein interaction network (PPI) software on Cytoscape to analyze 179 differential genes. A total of 126 genes were found to be acting on protein targets, and 10 of them were key genes, respectively: PSMB3, HSP701, HSPE1, STIP1, HSPD1, HSP70, DNAJB1B, HSP90AA1.1, HSP A9H, TCP1; Conclusion: The core genes mainly act on protein processing in endoplasmic reticulum pathway. It provides a new research direction for the potential biomarkers and biological mechanisms of arsenic induced liver injury.

Key Words: Bioinformatics analysis Microarray Arsenic Differentially expressed genes

自然界中砷分布广泛，在土壤、水和植物中都能检测出微量的砷^[1]。砷可以通过饮水、食物等方式进入人体 ^[2]。研究发现，过量的砷暴露能够引起人体多种脏器的损伤。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构将砷及其无机砷化合物列为一类致癌物 ^[3]。斑马鱼作为脊椎动物模型，与人类基因高度同源，其实验结果大多数情况下适用于人体^[4]。斑马鱼的肝脏对各种毒物极其敏感，Wolfram Goessling等人研究发现，斑马鱼胚胎发育迅速，其所有的消化器官在5天时发育成熟，因此斑马鱼是肝病研究的重要工具^[5-6]。因此肝脏疾病的研究中斑马鱼是重要的脊椎动物模型。美国国家卫生研究院将斑马鱼列为继大鼠和小鼠之后的第三大脊椎类模型生物，其信号传导通路与人类基本相似，在环境毒物等领域研究广泛^[7]。通过运用生物信息学方法可以有助于进一步研究砷暴露对机体危害的潜在机制。

1 数据来源与方法 1.1 搜索斑马鱼和砷微阵列数据信息

浏览NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在GEO DataSets搜索框中输入斑马鱼和砷；通过搜索获得了砷处理斑马鱼的肝脏组织和斑马鱼正常肝脏组织GSE30062和GSE3048的基因表达谱^[8-9]。GSE30062和GSE3048的微阵列数据均基于GPL2715平台，因此能够进行共同分析研究。其中GSE30062基因表达谱包括14个砷处理肝脏组织和10个正常肝脏组织；GSE3048的基因表达谱包括12个砷处理肝脏组织和12个正常肝脏组织。

1.2 Database of Essential Genes(DEG)的数据处理

通过GEO2R在线工具筛选出GSE30062和GSE3048的基因表达谱中的差异基因。然后，在线维恩软件分析原始数据，以| logFC | >1为依据，筛选出两个数据集中的高度差异基因。(其中log FC < 0的DEG被认为是下调基因，而log FC> 0的DEG被认为是上调基因)。

1.3 通过DAVID数据库对179个交集基因进行基因本体论和KEGG途径富集分析

用DAVID在线生物信息学工具(https://david.ncifcrf.gov)来分析差异基因的细胞组分(Cellular components CC)、分子功能(Molecular function MF)、生物过程(Biological process BP)和KEGG通路分析^[10]。

1.4 PPI网络和模块分析筛选核心基因

PPI信息可以通过在线工具STRING(用于检索相互作用基因的搜索工具)进行评估。然后，应用Cytoscape中的STRING应用程序检查这些DEGs之间的潜在相关性(最大相互作用数= 0和置信度得分≥0.4)。此外，通过Cytoscape中的MCODE应用程序用于检查PPI网络的模块(度数截止= 2，最大深度= 100，k-core = 2，节点得分截止= 0.2)，运用CytoHubba应用程序模块发现复杂网络的关键基因。

1.5 10个核心基因重新进行基因本体论(Gene Ontology，GO)和KEGG途径富集分析

运用蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)中MCOD模块和Cytohubba模块分析获得的关键基因的交集；共10个基因分别为：PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9H和TCP1。将筛选出的10个核心基因用DAVID在线生物信息学工具(https://david.ncifcrf.gov)来分析差异基因的细胞组分、分子功能、生物过程和KEGG通路分析。

1.6 10个核心基因在肝癌中的预后生存分析

Kaplan Meier绘图仪能够评估基因对肝癌等21种癌症类型的生存率的影响。该工具可以发现和验证生存生物标志物。打开Kaplan Meier-plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)网站，点击start KM Plotter for liver cancer选项，将要分析的基因输入Gene symbol中，最后点击Draw Kaplan-Meier plot选项^[11]。

2 结果分析 2.1 筛选肝脏组织中的DEGs

研究中有26个砷处理肝脏组织和22个正常肝脏组织。通过GEO2R在线工具，分别从GSE3048和GSE30062中提取了2 670和991个基因(图 1)。然后，使用维恩图软件来识别两个数据集中的常见差异基因。两个数据集的交集中有511个基因被上调(logFC> 0)；有424个基因被下调(logFC < 0)(图 2)。以| logFC |>1为筛选条件，进一步筛选有显著差异的基因，上调的511个基因中有169个基因符合要求(logFC> 1)；下调的424个基因中有10个基因符合要求(logFC < -1)(表 1)。

图 1 差异表达基因的火山图 Figure 1 Volcano diagram of DEGs

图 2 差异表达基因的韦恩图 Figure 2 Venn diagram of DEGs

表 1 差异表达基因 Table 1 Diagram of DEGs

DEGs	Gene name
Up-regulated	EIF4G2A、DDX39AB、YARS、FAM13B、FLNA、ARF5、WU: FK57A03、HSPA9、YWHABL、TMEM106A、PTP4A2B、SI: DKEYP-68B7.7、UCP2、DNAJB11、SDF2L1、FTH1A、CNN2、SLC16A9A、SI: CH211-191D15.2、WU: FC22G01///CFL1、LDHBA、HNRNPH1L、TOMM22、SLC40A1、TMEM167A、RELT、CNPY1、SI: CH211-51E12.7、PSMB6、TBCB、WU: FJ19D05、UBE2AL、TMEM33、SYPL2A、STAM、PCGF5B///WU: FD20C05、GSTT1B、CDV3、SEC22BB、WU: FK69E07、EIF4E1C、SNX9B、TMEM184BA、SUCO、WU: FJ34A03、NUDC、SI: CH73-329N5.6、SI: CH211-210H11.2///SF3B4、PRELID3B、ERH、FPGS、CLIC4、NIPA1、NOP16、PSMB3、ICE1、PSMB4、CX32.3、TOP1L、DNAJB1B、ABCC4、MGST3B、STIP1、CANX、GSTP1、RRBP1B///SB: CB461、ANXA11A、MAGOH、GLSB、RHEBL1、ATIC、HSP70L、GABARAPA、UGDH、VPS26A、YRK、FAUB、CTH、MRPS18B、CHRAC1、HSP90AA1.1、UBA1、PSME1、AMD1、TUBB4B、TMEM167B、HAS2、FKBP4、TMEM214、TMEM165、ERP44、SLC16A3、COPZ1、TSPAN36、CKMT1、GLULB、CTSLA、HYOU1、BCAT1、ZP3A.1、LAMP1、ZGC: 162025///ZGC: 103536、GAR1、SLC38A2、TALDO1、MLLT10、ACAT2、ATRNL1B、PPP6C、MKNK2B、KRT8///ID: IBD1152、HSP70.3、TCIRG1A、PSMD6、PSMB5、EIF4G2B、EPHB4A、COX14、ZGC: 152945、FAM210AA、TRAM1、TUBA8L4///WU: FB83C07、WU: FA11E08、PSAP、HSPD1、PCXB、LAMP2、WU: FK14C11、GCLM MYL12.1、RAC1A、ARF4B///ZGC: 110286///ARF4A、NOB1、PSMG2、PAM16、PPT1、USP10、PSMB7、SI: CH211-214C7.5、PSMB9B、RAB5AA、TCP1、ATP6V1BA、SDCBP2、CIRBPA///WU: FC43H11、DERL1、POMP、GCLC、BCKDHA、ID: IBD1087、ATP2A2B、POLH、JAK1、SMIM20、TCTA、HSPE1、UBE2J1、FUNDC2、NCL1、CYP2K19、TXNL1、OPTN、ELAVL1、SI: DKEY-13I19.8、BC2、WU: FC48B12、ACTB2、TPMT.2、CD2BP2。
Down-regulated	CYP2K6、HIC2、THRB、MHC2DAB、AR、LRRC17、WU: FC57C05、ACBD5A、CYP1A、ADH8A

表 1 差异表达基因 Table 1 Diagram of DEGs

2.2 对179个差异基因进行基因本体和KEGG通路分析的结果 2.2.1 179个差异基因用DAVID软件分析中的GO结果

在上调的差异基因中：1)对于生物过程(BP)，差异基因特别富集于蛋白质折叠、参与细胞蛋白质分解代谢过程的蛋白水解、蛋白质转运、谷胱甘肽生物合成过程等(表 2)；2)对于分子功能(MF)，差异基因富集于苏氨酸型内肽酶活性、内肽酶活性、ATP结合、细胞质部分、谷胱甘肽转移酶活性、肽酶活性等(表 2)；3)对于GO细胞成分(CC)，差异基因富集于蛋白酶体复合物、细胞质、谷氨酸-半胱氨酸连接酶复合物、内质网等(表 2)。

表 2 差异表达基因的基因GO分析 Table 2 Gene ontology analysis of DEGs

Expression	Category	Term	Count	%	P Value
Up-regulated	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0006457~protein folding	12	7.06	5.77×10-9
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0051603~proteolysis involved in cellular protein catabolic process	7	4.12	9.43×10-6
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0015031~protein transport	7	4.12	6.81×10^-3
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0071466~cellular response to xenobiotic stimulus	3	1.76	2.93×10^-2
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0006810~transport	17	10	3.22×10^-2
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0006750~glutathione biosynthetic process	2	1.18	4.25×10^-2
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0000502~proteasome complex	9	5.29	1.46×10^-8
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0005839~proteasome core complex	6	3.53	2.92×10^-6
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0005737~cytoplasm	35	20.59	4.56×10^-4
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0005759~mitochondrial matrix	5	2.94	1.31×10^-3
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0005783~endoplasmic reticulum	10	5.88	5.59×10^-3
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0017109~glutamate-cysteine ligase complex	2	1.17	164×10^-2
	GOTERM_CC_DIRECT	GO: 0005769~early endosome	3	1.76	3.34×10^-2
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0051082~unfolded protein binding	8	4.71	3.80×10^-7
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0004298~threonine-type endopeptidase activity	6	3.53	1.24×10^-6
own-regulated	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0071466~cellular response to xenobiotic stimulus	2	20	1.45×10^-2
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0055114~oxidation-reduction process	3	30	3.12×10^-2
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0043401~steroid hormone mediated signaling pathway	2	20	3.47×10^-2
	GOTERM_BP_DIRECT	GO: 0006351~transcription, DNA-templated	3	30	4.45×10^-2
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0046872~metal ion binding	6	60	5.44×10^-4
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0016491~oxidoreductase activity	3	30	1.67×10^-2
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0003707~steroid hormone receptor activity	2	20	3.04×10^-2
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0016705~oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen	2	20	4.25×10^-2
	GOTERM_MF_DIRECT	GO: 0004497~monooxygenase activity	2	20	4.62×10^-2

表 2 差异表达基因的基因GO分析 Table 2 Gene ontology analysis of DEGs

在下调的差异基因中：1) 对于生物过程(BP)，差异基因特别富集于细胞对异物刺激的反应、类固醇激素介导的信号通路、转录，DNA模板化等(表 2)；2) 对于GO细胞成分(CC)，差异基因富集于金属离子结合、氧化还原酶活性、类固醇激素受体活性、单氧化酶活性等(表 2)。

2.2.2 KEGG通路分析

KEGG分析结果显示，差异基因主要富集在蛋白酶体，吞噬体，内质网中的蛋白质加工，谷胱甘肽代谢，细胞色素P450对异生物质的代谢以及氨基酸的生物合成通路(P < 0.05)(表 3)；

表 3 差异表达基因的KEGG通路分析 Table 3 KEGG pathway analysis of DEGs

2.3 蛋白质- 蛋白质相互作用网络(PPI)和模块分析结果

结果显示：共有126个基因入选到PPI网络综合体中，其中包括120个上调基因和6个下调基因(图 3)；MCOD模块分析和CytoHubba模块分析结果取交集共有10个基因入选核心基因分别为：PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9和TCP1(表 4)。

图 3 蛋白质-蛋白质相互作用网络 Figure 3 Protein-Protein interaction network

表 4 MCOD模块和Cytohubba模块分析 Table 4 MCOD module and Cytohubba module analysis

2.4 10个核心基因重新进行GO分析和KEGG分析

蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)中MCOD模块和Cytohubba模块分析获得的关键基因的交集共10个基因分别为：PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9和TCP1。对这10个基因从新进行GO分析(表 5)和KEGG分析(表 6)

表 5 核心基因GO分析 Table 5 GO analysis of core genes

表 6 核心基因KEGG分析 Table 6 KEGG pathway analysis of core genes s

2.4.1 10个差异基因用DAVID软件分析中的GO结果

生物过程(BP)：核心基因特别富集于蛋白质折叠、对金属离子的反应、鳍再生见；

分子功能(MF)：核心基因富集于线粒体基质和细胞质；

GO细胞成分(CC)：核心基因富集于未折叠的蛋白质结合、ATP的结合和核苷酸的结合。

2.4.2 KEGG通路分析通路分析

结果显示核心基因富集于内质网中的蛋白质加工通路，DNAJB1、HSP90AA1.1、HSP70L靶基因对内质网中的蛋白质加工通路的作用靶点如图 4所示。

图 4 内质网中的蛋白质加工通路 Figure 4 Protein processing in endoplasmic reticulum

2.5 10个关键基因在肝癌中的预后生存分析

流行病学的研究结果表明，长期接触砷与肝癌的发生密切相关，对PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9和TCP1基因的在肝癌中的预后生存分析，在10个基因中只查找出有6个基因(PSMB3、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSPA9和TCP1)对肝癌患者的预后生存有影响，结果显示：TCP1、STIP1和HSPD1会降低肝癌的预后生存时间(P＜0.05)(图 5)。

图 5 核心基因在肝癌患者中的预后生存分析 Figure 5 Prognostic survival analysis of core genes in patients with liver cancer

3 讨论

砷暴露会对机体产生危害，研究发现砷的致病机理与氧化应激和免疫功能的损伤有关，引起皮肤、肝脏、肾脏、神经系统等损伤^[12-13]。肝脏被认为是砷生物转化和甲基化的主要器官，也是砷毒性的主要靶标^[14]；在斑马鱼中，长时间过量的砷暴露会改变肝脏细胞中细胞周期和脂质代谢基因的表达^[15]；在蛋白质组学研究中，砷暴露后会改变脂质转运和代谢途径中的蛋白质表达^[16]。

研究结果显示斑马鱼在急性砷暴露后会引起多种基因的改变，从GSE3048和GSE30062中提取了2 670和991个基因，经过进一步的筛选，得到179个符合条件的差异基因，这些上调的差异基因特别富集于蛋白质折叠、参与细胞蛋白质分解代谢过程的蛋白水解、蛋白质转运、谷胱甘肽生物合成过程等；差异基因富集于苏氨酸型内肽酶活性、内肽酶活性、ATP结合、细胞质部分、谷胱甘肽转移酶活性、肽酶活性等；差异基因富集于蛋白酶体复合物，细胞质、谷氨酸-半胱氨酸连接酶复合物、内质网等；下调的差异基因中，差异基因特别富集于细胞对异物刺激的反应、类固醇激素介导的信号通路、转录，DNA模板化等；差异基因富集于金属离子结合，氧化还原酶活性、类固醇激素受体活性、单氧化酶活性等。在KEGG通路分析后显示差异基因特别富集于蛋白酶体，吞噬体、谷胱甘肽代谢、细胞色素P450对异生物质的代谢通路。将176个基因用Cytoscape软件进行蛋白质- 蛋白质相互作用网络(PPI)和模块分析发现共有126个基因作用于蛋白靶点，其中有10个基因为关键基因分别为：PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9和TCP1。在肾细胞癌和肺癌患者中PSMB3基因的高表达对应更差的预后，其机制可能是PSMB3基因沉默剪接体Sm基因的表达^[17-18]。10个关键基因在肝癌中的预后生存分析发现：TCP1、STIP1和HSPD1会降低肝癌的预后生存时间。

研究表明，热休克蛋白(HSP)是一类高度保守的保护性蛋白，热休克蛋白在蛋白质分子结合过程中发挥作用，维持氨基酸链的三维结构、清除折叠错误的氨基酸链、减轻对机体的损伤^[19]。通过生物信息学分析结果发现在10个核心基因的KEGG通路分析结果涉及到dre04141：内质网中的蛋白质加工通路，该通路在蛋白质的生产过程中扮演重要角色，与我们预测到的热休克蛋白的功能一致；内质网(ER)是一种亚细胞器，帮助蛋白质进行正确的折叠，将正确折叠的蛋白质被包装成运输囊泡，对错误折叠的蛋白质通过蛋白酶体定向降解，同时过量的错误折叠的蛋白质会也会引起细胞死亡^[20]。在此次的研究发现的10个核心基因中，有HSP701、HSPE1、HSPD1、HSP70、HSP90AA1.1和HSPA9共6个基因属于热休克蛋白家族，已有研究表明亚砷酸钠作为热休克蛋白的诱导剂^[21]，该结果和我们此次生物信息学预测分析的结果一致。

4 结论

1) 在砷的机制研究中HSP701、HSPE1、HSPD1、HSP70、HSP90AA1.1和HSPA9等可能会是其新的研究方向；内质网中的蛋白质加工通路以及热休克蛋白可能成为砷引起的肝损伤以及肝癌研究新的方向。

2) PSMB3、HSP701、HSPE1、STIP1、HSPD1、HSP70、DNAJB1B、HSP90AA1.1、HSPA9和TCP1这十个基因可能在砷的毒性损伤进展中起关键作用。未来需要通过一系列实验来验证，这些数据可能会为砷对肝脏损伤的潜在生物标志物和生物学机制提供一些有用的信息。

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