结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤，最新的全球癌症统计报告显示，结直肠癌已居全球癌症发病谱第三位，死因谱第二位^[1]。预计2022年我国和美国将分别有大约482万和237万的新发癌症病例^[2]，结直肠癌发病率仍将高居前三，其形势不容乐观，而我国结直肠癌患者的预后较美国差。深入了解结直肠癌的分子机制、发现新的预后相关生物分子具有重要的意义。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitors, SERPIN)超家族，以丝氨酸为活性中心，控制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性，参与凝血、纤维蛋白溶解、炎症、补体激活、细胞凋亡和细胞迁移等生理病理过程^[3-7]。此外，SERPIN家族编码基因在多种肿瘤组织和正常组织间存在差异表达，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移^[8-9]，影响患者的生存与预后^[10-12]。已有研究表明SERPINs家族基因参与结直肠癌的发生、发展与迁移等生物学过程^[13-14]，然而，SERPINs家族基因与结直肠癌的肿瘤微环境的改变、免疫浸润情况以及生存预后的关系研究，仍存在一定的不足。

本研究通过分析TCGA数据库和GEO数据库中结肠腺癌的高通量测序数据，通过生物信息学方法探究SERPINs家族基因在结肠腺癌中的预后价值，构建SERPINs相关预后生存模型并进行验证，探讨SERPINs家族基因、预后、肿瘤微环境以及免疫浸润之间的相关性，以期通过生物信息学方法辅助结肠癌的基础研究，促进研究成果向临床方向的转化。

从TCGA数据库获得结肠腺癌(COAD)的RNA测序(RNA-seq)数据(肿瘤数据473例，正常组织数据41例)以及对应的临床信息，数据格式为标准化后的FPKM格式，并将转录组数据转换为更接近GEO数据信息的每百万读取数的转录本(Transcripts per million reads，TPM)格式，从GEO数据库下载GSE40967型文件，其中包含585例结肠腺癌转录组数据及临床数据。通过GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)检索以及TCGA数据库和GEO数据库中现有COAD转录组测序数据，筛选出SERPINA1/2/3/4/5/6/7/9/10/12、SERPINB1/2/3/4/5/6/7/8/9/9P1/10/11/12/13、SERPINC1、SERPIND1、SERPINE1/2、SERPINF1/2、SERPING1、SERPINH1及SERPINI1/2共34个SERPIN家族成员进行分析研究。

将TCGA数据和GEO数据进行合并，剔除其中年龄、性别、生存状态、临床病理特征等重要临床信息缺失以及正常组织的样本，最终获得1 034例COAD患者信息，利用R包“ConsensusClusterPlus”对SERPINs家族基因表达矩阵进行一致性聚类分析^[15]，依次选取聚类值(k)1~9，再根据聚类效果选择聚类稳定性较高的k值。

以“c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt”为参考基因集利用“GSVA”包对不同聚类簇进行基因集变异分析(GSVA)，P < 0.05有统计学意义，以确定两个不同聚类簇之间的生物通路差异；并利用“GSVA”包的单样本富集分析(ssGSEA)算法计算不同分型COAD患者的免疫浸润丰度。

利用R包“caret”将1 034例COAD患者随机均分为两组，训练集(Train)组和验证集(Test)组各517例。训练集(Train)用于构建预后风险模型，而验证集(Test)用于验证模型。利用“limma”包筛选COAD聚类簇之间的差异表达基因(DEGs)，筛选条件：| Log2FC|＞0.585，FDR＜0.05，然后利用单因素Cox回归分析筛选出预后相关的DEGs，再利用多因素Cox回归分析和LASSO回归分析构建预后风险模型：

即：用基因的表达水平与其对应的系数相乘，根据风险评分的中位值将样本分为高风险组合低风险组，利用“survminer”R包对高、低风险组进行Kaplan-Meier分析，评估两组样本的生存率差异，并应用“timeROC”包绘制时间依赖性ROC曲线，评估模型基因的预测稳定性。结合临床数据和风险评分绘制出列线图、校准曲线以及风险曲线对模型进行评估验证。

与41例正常组织相比，在COAD患者中多个SERPIN家族成员存在异常表达，SERPINB1、SERPINB9、SERPINB5、SERPINB2、SERPIND1、SERPINE2、SERPINA7、SERPINF2、SERPINE1、SERPINH1以及SERPINA4表达显著上调(图 1(a))，SERPINA9、SERPINA6、SERPINF1、SERPING1以及SERPINA5表达显著下调，通过分析34个基因共表达关系及其对COAD的预后影响，我们构建了SERPIN家族在COAD中的预后网络图，其中SERPINB7、SERPINE1、SERPINH1和SERPINI1的表达水平与COAD具有显著的预后关系(图 1(b))。

图 1(Figure 1)

图 1 SERPIN家族基因在COAD中的表达 Figure 1 Expression of SERPIN family genes in COAD

为了进一步研究SERPIN家族基因在CAOD中的表达特点，根据34个SERPIN基因的表达情况采用一致性聚类算法对COAD患者进行分类，当k=2时分型最佳，此时分型内部相关性最高，分型之间相关性最低(图 2(a))，在此基础上，进行主成分(PCA)分析，分离结果显示，能根据SERPINs家族基因的表达量能够区分分型1与分型2(图 2(b))，不同分型之间的生存分析结果显示，分型1的生存率显著高于分型2(图 2(c))，此外，用热图展示SERPINs的表达谱与COAD分型以及临床病理特征之间的关系，包括分型、年龄、性别、肿瘤分级、T、N、M分期(图 2(d))，(同时也进一步显示出来源于GEO和TCGA两个数据库的COAD数据在分型和临床病理分期上结果的高度一致性，此处是解释两聚类簇分型较好非数据库不同造成，来源于TCGA和GEO数据库在分型结果上一致)。

图 2(Figure 2)

图 2 基于SERPIN家族基因的肿瘤分型 Figure 2 Tumor classification based on SERPIN family genes

通过GSVA分析不同COAD分型间的信号通路差异，结果表明：分型1的COAD样本在过氧化相关通路上有显著的富集，而分型2在Toll样受体信号通路、趋化因子信号通路、细胞黏附分子通路以及MAPKA信号通路等都有显著的富集(图 3(a))。ssGSEA分析发现，分型Ⅱ较分型Ⅰ具有更高的免疫相关细胞水平，如活化型CD4+细胞、活化型B细胞、活化型树突状细胞、自然杀伤细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等(图 3(b))。

图 3(Figure 3)

图 3 聚类簇的富集分析 Figure 3 Enrichment analysis of clusters

对两种分型的COAD进行差异基因分析，确定了1 078个差异基因，运用单因素COX回归分析从这些DEGs最终筛选出435个预后相关的差异基因；在训练集(Train)数据中应用LASSO回归和多因素COX回归确定出11个预后基因进行风险评分模型的构建(图 4(a)，图 4(b))；预后风险评分=0.1832×TIMP1+0.2249×LAMA2-0.1505×EPHB2-0.1985×CXCL13+0.1874×PRRX2+0.1473×EGR3-0.1993× ABAT-0.1101×CXCL11+0.1545×FOXD1-0.0923×MMP3-0.0619×ITLN1。根据train组风险评分的中位值将train组分为低风险组和高风险组，高低风险组生存分析结果显示，低风险组患者具有明显的生存优势(图 4(c))，时间依赖性ROC曲线显示，训练集(Train)的1、3、5年生存率的AUC值分别是0.717、0.717、0.720(图 4(f))。通过验证集(Test)和总体(All)数据集利用模型风险评分预测COAD患者1、3和5年生存率AUC-ROC与训练集(Train)相似(图 4(d)，4(e)，4(g), 4(h))。

图 4(Figure 4)

图 4 SERPIN家族相关基因风险评分模型的构建与验证 Figure 4 Construction and validation of SERPIN family related gene risk scoring model

为了进一步验证风险评分模型对COAD患者的预后价值，根据多因素COX回归分析结果，构建一个包含年龄、性别、风险评分以及临床病理特征的列线图来估计COAD患者1、3、5年的总体生存期(OS)(图 5(a))，该列线图的校准曲线也显示了预期值与观测值高度一致性(图 5(b)), 与高低风险相关的SERPIN家族基因(图 5(c))，与低风险评分COAD患者相比，高风险患者中SERPINB2、SERPINE1、SERPINF1、SERPINA5、SERPIND1、SERPINB6、SERPINA3、SERPING1、SERPINB5、SERPINE2、SERPINH1表达上调，而SERPINA6和SERPINA7表达下调。

图 5(Figure 5)

图 5 预测列线图的构建和验证 Figure 5 Generation and validation of predictive nomogram

利用ESTIMATE算法^[16]计算不同风险组COAD患者免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分，根据评分结果比较不同风险组COAD患者肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)特征，结果显示，高风险组基质细胞的含量高于低风险组，而免疫细胞的含量在低风险组中含量更高(图 6)。随后，利用CIBERSORT免疫浸润算法^[17]评估风险评分与患者免疫细胞浸润之间的相关性，我们发现，记忆B细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、活化型肥大细胞、中性粒细胞与风险评分呈正相关，初始B细胞、静止型树突细胞、M1巨噬细胞、活化型CD4⁺记忆T细胞、CD8⁺细胞、滤泡辅助性T细胞呈负相关(表 1)。

图 6(Figure 6)

图 6 肿瘤微环境与风险评分关系 Figure 6 Relationship between tumor microenvironment and risk score

表1(Table 1)

表 1 COAD风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性分析 Table 1 Correlation analysis between COAD risk score and immune cell infiltration 免疫细胞 相关系数(R) P 记忆B细胞 0.073 2.9×10-2 初始B细胞 -0.18 4.0×10-8 静止型树突细胞 -0.11 9.1×10-4 M0巨噬细胞 0.19 1.4×10-8 M1巨噬细胞 -0.26 2.0×10-15 M2巨噬细胞 0.1 2.4×10-3 活化型肥大细胞 0.14 2.3×10-5 中性粒细胞 0.21 4.0×10-10 活化型CD4+记忆T细胞 -0.35 2.2×10-16 CD8+T细胞 -0.15 1.4×10-5 滤泡辅助性T细胞 -0.19 8.3×10-9

表 1 COAD风险评分与免疫细胞浸润之间的相关性分析 Table 1 Correlation analysis between COAD risk score and immune cell infiltration

SERPIN是目前已知亚型最多的蛋白酶抑制剂家族，参与机体血液凝固、血管生成、炎症反应、细胞迁移等多种生物学功能，行为广泛，作用复杂，影响肿瘤微环境^[18]，诱发免疫状态的改变^[19-20]，促进肿瘤的发转移与侵袭。基于目前SERPIN基因在在结直肠癌中个研究仍有不足，其在结肠腺癌中的致病意义仍未完全明确，本研究第一次利用生物信息学方法，通过SERPIN家族相关基因构建在结肠腺癌中的预后评分模型，该模型能够预测COAD患者的生存率，反映肿瘤微环境、免疫浸润与COAD的相关性。

研究发现，许多SERPIN家族成员在COAD中存在异常表达。已有研究表明SERPINE1、SERPINH1和SERPINI1在结肠癌的发生发展、侵袭转移中发挥重要作用^{[14, 21-22]}，SERPIN家族成员在COAD的作用机制是非常复杂的，我们的研究结果证实了SERPINE1、SERPINH1和SERPINI1在COAD中是高风险因子，过表达影响患者预后。此外，我们还发现SERPINB7在COAD患者中存在异常表达，且影响患者预后，但目前仍缺乏SERPINB7在COAD方面的研究，其具体作用机制有待进一步发掘。此外，依据SERPIN的表达量将COAD患者分为两个聚类簇，分型Ⅱ较分型Ⅰ预后较差，然而在免疫细胞浸润分析中发现，分型Ⅱ较分型Ⅰ具有更多的免疫细胞富集，这提示SERPIN家族可能通过影响免疫细胞的表达和功能等影响COAD的预后。

本研究筛选出11个SERPIN相关预后基因进行COAD预后模型的构建，该模型在训练集(1、3、5年AUC均＞0.7) 和验证集(1、3、5年AUC均＞0.6)以及总体样本(1、3、5年AUC均＞0.6)中均表现出良好的预测效能。根据SERPIN家族成员在该模型中高低风险组表达情况我们发现，SERPINA6和SERPINA7在低风险组高表达，这提示SERPINA6和SERPINA7可能是一种保护基因，既往研究发现，SERPINA6编码血浆皮质类固醇结合球蛋白(CBG)^[23]，SERPINA7编码甲状腺素结合球蛋白(TBG)^[24]，参与人体的体液调节，但其目前在COAD中的作用尚不明确。SERPINB2、SERPINE1、SERPINF1、SERPINA5、SERPIND1、SERPINB6、SERPINA3、SERPING1、SERPINB5、SERPINE2、SERPINH1在高风险组表达上调，这提示这些基因高表达的COAD患者预后不良。有研究表明，SERPINB2可能通过炎症调节，参与结直肠癌的调节^[25]，SERPINF1的过表达增加结直肠癌抗PD-1抗体的抗性，增强肿瘤耐药性^[26]。SERPINA5能通过PI3K/AKT途径发挥致癌基因作用促进胃癌的增殖和转移^[27]。SERPIND1能通过PI3K/AKT途径促进卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭^[28]。沉默SERPINA3能够减少MMP-2和MMP9的表达，抑制结肠癌侵袭和转移^[29].随着研究的深入和技术的发展，越来越多的证据表明SERPIN家族通过多种途径在癌症中发挥作用，就我们研究来看，SERPIN家族在COAD中的研究仍有很大的研究空间，仍需要大量的基础实验进一步验证和发掘。

肿瘤微环境(TME)包括浸润性癌巢及其周围的基质细胞和免疫细胞，近年来，越来越多研究表明TME在肿瘤的发生和转移中起着至关重要的作用^[30-31]，我们的风险评分与肿瘤微环境成分相关性分析结果显示，低风险组具有更高的免疫细胞含量。此外，我们的免疫细胞浸润分析也证实了这一点，低风险评分的COAD样本具有更好的免疫细胞浸润。这提示TME和免疫状态的调节可能是SERPIN基因影响COAD患者预后的原因之一。

综上所述，SERPIN家族相关基因构建的预后模型可用于预测COAD的患者的预后，有利于进一步指导临床对COAD的诊疗。该评分模型同时也表明TME和免疫状态在COAD的预后中也发挥着重要的作用，此外，许多SERPIN家族成员在COAD中风险性也通过该模型得以展示，但其在COAD中的具体调控途径和作用方式仍需进一步研究和验证。