2023, Vol. 21
大多数真核生物的编码区是不连续的，编码蛋白质的序列在基因序列中被非编码序列隔开(见图 1)。编码的序列又称为外显子(Exon)，携带着遗传信息，能够决定和指导生物的性状；非编码序列又称为内含子(Intron)[1]。如果一个基因有n个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成n+1个部分。且内含子的核苷酸数量比外显子多许多倍[1-2]。因此，外显子和内含子的准确识别是一个具有挑战性的研究。外显子和内含子区分也有助于研究基因功能、基因表达、基因注释、基因转录调控，对于内含子功能的研究也具有一定的辅助作用[3-4]，故外显子和内含子的分类具有重要的意义。
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图 1 真核生物外显子与内含子交替示意图 Figure 1 Schematic diagram of exon intron alternation in eukaryotic coding region |
多年来，学者们已经提出了基因编码区(外显子)预测的多种方法。一般可以分为基于同源比对的方法和不依赖同源比对的方法。基于序列同源性的方法是以现有的基因数据库为标准，对待检测DNA序列进行相似性识别，从而根据已有经验判断未知序列的外显子和内含子区域。BLAST[5]、MUSCLE[6]是常见的比对工具，近年来也有诸如GeMoMa[7]的基因预测程序被提出。基于序列同源性的方法准确率较高，但测序成本高、比对效率等因素制约了该项技术的发展。基于此，许多的学者将研究重点转向不依赖比对技术的模型。数字信号处理技术在该领域发挥着关键的作用[8]。且数字信号处理前通常需对DNA序列进行数值映射[9]。VOSS[10]是一种广泛使用的固定映射技术，它将DNA序列转化为4个二进制指示符序列XA[n], XC[n], XG[n], XT[n]。核苷酸在特定碱基位置出现用1表示，未出现用0表示。Z曲线理论[11]是基于物理化学性质的映射方式。利用传统四面体的对称性开发，它将DNA或RNA序列映射到折叠曲线中。Z曲线表示出DNA序列携带的所有信息[8]，可用于基因鉴定和DNA或RNA序列分析[12]、识别细菌和古细菌基因组中蛋白质编码基因[13]等。此外，在众多序列编码方法中，k字符相对频率技术(k-mer)[14]是较常见和简便的方法。图 2展示了当k为4步长为1时的短序列的k-mer生成过程。机器学习的迅猛发展也为蛋白质编码区的识别带来了许多新的算法。如CNN-MGP[15]、GeneMark EP+[16]、DBN[17]。CNN-MGP[15]是用于宏基因组学基因预测的卷积神经网络，能够提取编码区和非编码区的特征。GeneMark EP+[16]是用于真核基因预测的算法和工具。深度置信网络DBN[17]通过多层玻尔兹曼机对DNA序列进行数值转换，用深度置信网络模型对外显子和内含子分类判别。尽管已经有许多的外显子与内含子分类方法被提出，但是准确率、敏感度、特异度、AUC值等评价参数还有待提升。
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图 2 k字符相对频率技术提取k-mer示意图(k=4) Figure 2 Schematic diagram of k-mer extraction by k-character relative frequency technology(k=4) |
将数值映射和机器学习分类器相结合，提出了一个组合算法(具体流程见图 3)。首先，给定一个外显子或内含子，将其通过密码子与氨基酸的对应转换为特定的氨基酸序列，此处的转换不同于标准的翻译过程。然后，利用经典的k-mer技术获取序列的特征向量。最后，将外显子与内含子的特征向量输入逻辑回归分类器中，训练模型并识别蛋白质编码区(外显子)。利用真核生物基准数据集HMR195和BG570对模型进行了五折交叉验证，AUC值分别达到了0.981 3和0.987 4。将两个数据集合并计算时，敏感度和特异度分别为0.954 1、0.942 8。通过对比发现，新算法的识别结果明显优于VOSSDFT、传统的贝叶斯判别等方法。新算法识别HMR195和BG570数据集的时间为1.46 s、3.58 s，表明组合模型能够高效又准确地鉴定真核生物的外显子和内含子。
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图 3 本文算法的框图 Figure 3 Block diagram of the algorithm in this article |
本文对真核生物的DNA序列进行编码区判别分析，实验中用到2个基准数据集，分别是HMR195[18]和BG570[19]数据。HMR195数据由195个哺乳动物DNA序列组成，包括人类、小鼠和大鼠，共948个外显子。BG570是指由570个脊椎动物序列组成的基因组测试数据集，共2 649个外显子。两个数据集可从网址http://www.imtech.res.in/raghava/genebench中获取。基准数据集的长度范围、外显子数目和内含子数目如表 1所示。为了保证对外显子和内含子分类的全面性，将短的(长度低于20 bp)外显子和内含子序列也加入了实验中。
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表 1 基准数据的外显子和内含子分布表 Table 1 Exon and intron distribution table of benchmark data |
在实现外显子和内含子的精准分类与预测前，通常需要对DNA序列进行数值映射，即将DNA序列转化为一个数值形式的表示[17]。本文提出了一个全新的DNA序列数值化映射方法，结合k-mer技术[14]，将DNA序列中的外显子和内含子分别转化为一个特征向量。下面介绍特征向量的提取过程：
给定一个外显子ACAGCGACC：第1步，从第一个核苷酸A处开始，通过每次仅移动一个核苷酸，将外显子转化为一段特定氨基酸序列，具体为，‘ACA’对应氨基酸T，‘CAG’对应氨基酸Q，‘AGC’对应氨基酸S，‘GCG’对应氨基酸A，‘CGA’对应氨基酸R，‘GAC’对应氨基酸D，‘ACC’对应氨基酸T，由此得到一段特定氨基酸序列为TQSARDT；第2步，结合经典的k字符相对频率技术，规定k值从1至5变化，将TQSARDT转化为特征向量。假设k=2，则2-mer种类包括TQ、QS、SA、AR、RD、DT。特征向量由2-mer频数构成，即(fTQ, fQS, fSA, fAR, fRD, fDT)=(1, 1, 1, 1, 1, 1)，其中fTQ表示TQ的频数。
1.2.2 DNA序列的特征提取DNA序列特征提取源于特定氨基酸序列k-mer的种类和数值频率。具体来说，特征向量的元素(即所有的k-mer种类)是DNA序列的特征，即1.2.1节提到的TQ、QS等。通常来讲，一段氨基酸序列中的k-mer种类数为20k。但是，由于特定氨基酸序列的转化不同于生物学中标准的翻译过程，且存在不同的密码子对应同一种氨基酸，所以本算法的k-mer种类数远远少于20k，这大大节约了计算时的内存消耗。以脯氨酸P为例，如图 4，它由4个密码子编译CCT、CCC、CCA、CCG，由本文的转化过程，P后的下一个氨基酸共5种，分别为亮氨酸L、组氨酸H、谷氨酰胺Q、脯氨酸P、精氨酸R，远少于20种。因此，每个氨基酸后可能出现的氨基酸种类少于20种。最终k-mer组合种类数随之大大减少，也就是说本文的转化过程大大降低了特征向量的维度。表 2列出了k=2时的全部95种特征向量的元素特征。
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图 4 脯氨酸P后面会出现的氨基酸种类示意图 Figure 4 Schematic diagram of amino acid types that will appear after P |
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表 2 k=2时，特征向量的95种元素 Table 2 When k = 2, 95 elements of eigenvector |
表 3列出了部分短外显子或内含子的特征向量(以k=2为例)详细求解过程。规定外显子类别为1，内含子类别为0。
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表 3 当k=2时，部分外显子和内含子序列的特征向量 Table 3 When k=2, eigenvectors of some exon and intron sequences |
在完成DNA序列的数值转换后，为了找到最适合特征向量的二分类模型，本文对五种分类器进行了尝试和验证，分别是随机森林(Random forest)[20]、逻辑回归(Logistic regression)[21]、高斯朴素贝叶斯(Gaussian naive bayes)[22]、支持向量机(SVM)[23]、k最邻近分类算法(KNN)[24]。计算时，采用五折交叉验证[25]。五折交叉验证是判断分类器性能的一种统计分析方法。它将原始数据分为5组，不重复地抽取其中4组作为训练集，剩余的1组作为测试集，共得到5种测试结果，最终取用平均数。
为了对5种不同的算法进行有效的对比和测度，此处使用三个评价指标ROC(Receiver operating characteristic)曲线、AUC值和近似相关系数AC值。ROC曲线[26]是以假阳率(False positive rate)作为横轴线(成本)，以真阳率(True positive rate)作为纵轴线(收益)，来说明在各种阈值条件下的假阳率和真阳率的关系曲线。ROC曲线与对角线的距离愈接近，表明试验中识别编码区与非编码区的能力愈弱，亦即该方法的分类预测能力愈弱。为了更准确地描述算法的判别能力，通常将ROC曲线下的区域面积用AUC[26]进行定量和比较，AUC数值愈接近1，说明分类的有效性越好。近似相关系数AC[26]是一种得到普遍认可的综合评估指标，TP(True positive)为外显子被正确预测的个数，FP(False positive)为预测为外显子但实际为内含子的个数，TN(True negative)为内含子被正确预测的个数，FN(False negative)为预测为内含子但实际为外显子的个数。此外，为了检验结果的统计学显著性，采用Delong检验[27]对ROC-AUC进行成对比较，p<0.05被认为具有统计学意义。
| $ \begin{aligned} A C= & \frac{1}{2} \times\left[\left(\frac{\mathrm{TP}}{\mathrm{TP}+\mathrm{FN}}+\frac{\mathrm{TP}}{\mathrm{TP}+\mathrm{FP}}+\frac{\mathrm{TN}}{\mathrm{TN}+\mathrm{FP}}+\right.\right. \\ & \left.\left.\frac{\mathrm{TN}}{\mathrm{TN}+\mathrm{FN}}\right)-2\right]\end{aligned} $ | (1) |
具体实验结果如图 5、图 6和表 4所示。图 5中，k=2时，在HMR195数据集，逻辑回归的AUC平均数分别为0.981 3，明显高于其他模型的结果。如图 6，BG570数据集也得到类似的结果，逻辑回归算法在所有k值优于其他算法。
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图 5 HMR195数据集中，五种算法AUC值的热图 Figure 5 In HMR195 data set, heatmaps of AUC values of five algorithms |
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图 6 BG570数据集中，五种算法AUC值的热图 Figure 6 In BG570 data set, heatmaps of AUC values of five algorithms |
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表 4 k从1至5，5种算法的AC平均值 Table 4 K from 1 to 5, mean AC value of 5 algorithms |
AC值对比结果如表 4所示，k=2时，逻辑回归取得了最大的AC值。AC值兼顾了TP、TN、FP、FN四个参数的值。AC值越大，表明分类效果越好。同时可以发现，当k取其他值时，逻辑回归算法相较其余四种方法也具有明显的优势。因此，由特征向量与逻辑回归组合的分类模型较准确。
2.2 组合模型的确定最终，组合模型确定为特征向量与逻辑回归分类器的结合。首先，将DNA序列转化为特定的氨基酸序列；其次，由特定氨基酸序列得到特征向量。最后，将特征向量放入逻辑回归分类器中，获得外显子和内含子的预测结果。
如图 7，选取五折交叉验证中的一次实验结果，画出ROC曲线图(k=2)。可以明显看出，组合模型最贴近面积为1的四边形线，分类效果较好。并且，HMR195的结果具有统计学显著性(逻辑回归VS随机森林：p=5.07×10-8；逻辑回归VS朴素贝叶斯：p=4.99×10-16；逻辑回归VS支持向量机：p=7.74×10-10；逻辑回归VS k最邻近算法：p=8.91×10-7)。BG570数据的试验结果也显著(逻辑回归VS随机森林：p=8.05×10-16；逻辑回归VS朴素贝叶斯：p=3.70×10-54；逻辑回归VS支持向量机：p=4.67×10-9；逻辑回归VS k最邻近算法：p=1.24×10-7)。
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图 7 五个算法模型的ROC曲线图 Figure 7 ROC curves of 5 algorithm models |
为了说明本文新方法与其余方法的优劣，将其与经典的VOSSDFT[10, 28]、EIIPDFT[28-29]、SPDFT[28, 30]和Code13-Marple[28]进行了比较。VOSSDFT、EIIPDFT、SPDFT均是基于离散傅里叶变换的技术(Discrete Fourier Transform, DFT)来区分真核生物外显子和内含子[10, 29-30]。Code13-Marple是一种基于自回归谱分析和小波变换的集成算法。由表 5，以HMR195为例，新方法(k=2)的AUC值达到了0.981 3，比其余四种方法分别高出了0.418 7、0.470 0、0.385 1、0.263 4；在BG570数据集上，AUC和AC值也远远超过其余四种模型中的最大值。新算法明显优于其他三种传统的基于DFT的方法和Code13-Marple。
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表 5 组合模型与其他方法的比较 Table 5 Comparison of eigenvector method with other methods |
为验证算法在较大数据集上的分类效果，将HMR195和BG570两组数据合并得到合并数据集，共3 597个外显子、4 354个内含子。此外，为了更加全面的评估组合模型的性能，增加了准确率、敏感度、特异度以及运行时间这四个对比维度，并与经典的贝叶斯判别法[31]进行比较。贝叶斯判别法是进行判别分析的一种多元统计分析方法。合并数据集后，k值取3时本文算法得到最好的预测结果。
| $ a c c=\frac{\mathrm{TP}+\mathrm{TN}}{\mathrm{TP}+\mathrm{FP}+\mathrm{TN}+\mathrm{FN}} $ | (2) |
| $ S_n=\frac{\mathrm{TP}}{\mathrm{TP}+\mathrm{FN}} $ | (3) |
| $ S_p=\frac{\mathrm{TN}}{\mathrm{TN}+\mathrm{FP}} $ | (4) |
表 6是两种方法的对比分析表，其中准确率acc[26]为全部序列中被正确预测的序列的比例；敏感度Sn[26]为所有实际外显子中被正确预测为外显子的比例；特异度Sp[26]为所有真实的内含子被正确预测为内含子的比例。在合并后的较大数据集上，组合模型的敏感度Sn为0.954 1远远大于贝叶斯判别法的0.787 2。在运行时间方面，组合模型只需要8.91 s，而贝叶斯判别法需要27.28 s。因此，本文方法不仅适用于小数据集，在较大数据集上同样表现优异，并且运行速度快于贝叶斯判别法。本文组合模型以及贝叶斯判别法的计算基于处理器为Intel(R) Core(TM) i7-8550U CPU@1.80 GHz和16.0 GB RAM的设备，使用Python3.8编程获得。
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表 6 二种模型的比对结果分析表 Table 6 Analysis table of comparison results of two models |
本研究提出了一个基于特征向量的数值映射方法，之后结合逻辑回归算法，对基因外显子和内含子实现了精确的分类。将组合模型运用到编码区识别，给出了一个全新的研究视角。为了证明组合模型的可行性，利用HMR195和BG570两个真核生物数据集，将其与现有的成熟方法进行了对比(见表 5和表 6)，均证明了它的有效性。此外，为证实模型在更大数据集上的效果，本文新收集了462条人类DNA序列[32]进行试验，共包含2 843个外显子，2 381个内含子。全部数据可从网址https://www.fruitfly.org/sequence/human-datasets.html获取。当全部数据共同训练时，共6 440个外显子，6 735个内含子。本文方法实验结果：acc、Sn、Sp、AC、AUC的值分别为0.957 7、0.966 6、0.949 0、0.915 5、0.989 4(k=2)。当扩大数据集后，组合模型对于外显子和内含子依然能起到很好的识别效果。其次，1.2.2节中特征向量的提取过程充分利用了密码子的简并性，降低了特征向量的维度。然而本文还未将外显子和内含子的结构信息作为特征的重要因素，之后的研究中会考虑加入结构信息，从而进一步提升模型的性能。并且，本文后续研究仍将扩大样本量，尝试更多更全面物种的蛋白质编码区分类，争取构建快速便捷的外显子与内含子识别工具。
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