抑郁是一种情绪障碍，以心理愉悦感消失、情绪低落超过2个星期、明显躯体不适和功能缺陷为特征，临床表现为失眠、意志减退、食欲异常、精神颓废等，严重者有自杀倾向^[1]。世界卫生组织(WHO)表示，截至2017年，全球患有抑郁症的人数约为3.22亿，而2005—2015这十年间，抑郁症的患病率提升了18.4%^[2]。目前，临床上大部分抗抑郁药治疗周期长，有严重的副反应，且费用高昂，给抑郁症患者及家庭造成了巨大的压力^[3]。因此，研究分子机制及靶点，研制出安全且高效的药物对抑郁症的治疗极为重要。

槲皮素(3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮)是一种普遍存在于人类膳食中的类黄酮物质^[4]。广泛存在于桑树、山茶花、菖蒲、辣木、金丝桃、葱、苜蓿、刺槐、葡萄和银杏叶中^[5]。槲皮素具有许多生物活性，例如抗氧化剂、抗炎、神经保护和脑保护等^[6]。一项膳食类黄酮摄入量与认知功能的队列表明，较高的类黄酮膳食摄入量可能与成年个体更好的认知健康有关，并且在单个多酚中，只有槲皮素与认知健康相关^[7]。FANG Ke等^[8]发现，槲皮素可以缓解大鼠腹膜内注射脂多糖(LPS)诱导的抑郁症。Samad等^[9]也证明，槲皮素可以防止压力引起的焦虑和抑郁样行为，并改善雄性小鼠的记忆力。但截至目前，槲皮素改善抑郁的具体作用机制并未得到充分解释。

网络药理学是一门从系统生物学和网络生物学中衍生而来的新学科^[10]。建立成分、靶点、疾病间的生物网络关系是其常用方法，以研究药物对机体的整体影响以及具体作用机制。本文拟采用网络药理学及分子对接技术，探讨槲皮素对抑郁的作用机制，为临床应用提供依据，以期开发出新的药物用于抑郁症的治疗。

1 资料与方法 1.1 药物靶点的收集

在Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中收集槲皮素(Quercetin)名称、结构等相关信息，下载其二维结构并以SDF格式储存。将该文件导入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)平台草图绘制器，蛋白质靶标种类选择“智人”，对靶点进行预测。SwissTargetPrediction平台可以鉴定具有与查询分子高度相似的已知配体的蛋白质，进而预测分子的靶标。进行预测时，3D相似性值的阈值设置为0.75，2D相似性值的阈值设置为0.45^[11]。低于这些阈值，配体与查询分子的相似性非常低，不显示在结果中。接下来在Superpred(https://prediction.charite.de/)数据库中收集槲皮素的靶点。Superpred生物物种默认为“智人”，置信度为大于等于0.7，采用逻辑回归机器学习模型对靶点进行预测。将收集到的靶点置于同一Excel文档中，进行去重整合，校正为人源靶点。

1.2 疾病靶点收集

以“Depression”为关键词，分别在OMIM(https://omim.org)和Genecards(http://Genecards.org)两个数据库中获取抑郁疾病靶点信息。在OMIM中选择具有已知序列的基因进行搜索。在Genecards中，若靶点数目过多，则以大于等于“Relevance score”的2倍中位数为筛选条件。将靶点信息置于同一Excel文档中，整合抑郁相关靶点。

1.3 蛋白质互作网络(PPI)构建及核心靶点筛选

通过Jvenn(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html) 对槲皮素和抑郁靶点求交集，获得槲皮素-抑郁的共同靶点，以CSV文件形式导出。将交集靶点文件上传至STRING平台(https://cn.string-db.org/)进行PPI构建，蛋白质类型设置为智人，置信度设置为中等(0.400)。再将该网络数据导入到Cytoscape3.9.1应用软件，并使用CytoHubba插件中的MCC算法筛选出度值排行前10的基因为hub基因。CytoHubba插件是基于应用程序编程接口在Java中实现的。PPI网络中每个节点定义为v，度值定义为F(v)。MCC计算后的度值定义为$\operatorname{MCC}(v)=\sum_{\mathrm{C} \in \mathrm{S}(v)}(|\mathrm{C}|-1) !$，其中S(v)是包含v的最大集团的集合，$(|\mathrm{C}|-1) !$是所有小于|C|的正整数的乘积^[12]。

1.4 GO和KEGG富集分析

在David平台输入槲皮素-抑郁的共同靶点进行富集分析，物种选择“Homo sapiens”，最小基因数目为2，评分阈值<0.1。利用Excel软件计算并筛选富集分析中校正后P<0.05的项，并对GO生物过程、GO分子功能以及GO细胞成分分析的前15项进行可视化展示。KEGG通路按校正后P值大小排序，利用R软件，以图片形式对前15条通路进行展示。

1.5 分子对接

在RCSB PDB(https://www.rcsb.org)下载度值前五的蛋白分子对应的复合体晶体结构，删除配体部分，去除水分子，利用Discovery Studio2019中Macromolecules/Prepare Protein/Clean Protein功能对蛋白分子进行预处理。接着利用LibDock依次进行分子对接，并需要LibDockScore以确定靶点蛋白与槲皮素之间的结合力，得分较高的组分被视为与槲皮素相互作用的活性组分。

2 结果 2.1 药物及疾病靶点的收集

在SwissTargetPrediction数据库收集到100个槲皮素靶点，在Superpred数据库收集到111个靶点。取并集后共获得槲皮素人源靶点198个。在Genecards平台共查询到3 675个抑郁靶点，在OMIM平台共查询到188个靶点，去重合并后共获得疾病相关靶点3 718个。

2.2 PPI网络以及核心靶点分析

Jvenn中共获得103个槲皮素-抑郁共同靶点，用韦恩图表示(见图 1)。利用STRING平台绘制槲皮素和抑郁交集靶点的PPI网络图，包括103个节点，536条边。将其结果信息上传至Cytoscape3.9.1软件进行简化(见图 2)。经MCC算法计算后, 度值排名前10的hub基因依次为: SRC、MTOR、EGFR、AKT1、PTK2、CXCR4、KDR、IGF-1R、PIK3R1、PTPN11。依据MCC分数对hub基因进行可视化(见图 3)，颜色由红转黄，MCC得分越高，其基因颜色越趋近于红色。

2.3 GO与KEGG通路分析

应用David平台进行GO、KEGG富集分析。GO是基因本体(Gene ontology)的简称，用于注释与其相关的生物功能、通路、以及其他的基因产品。经校正后P＜0.05的富集条目筛选，获得了162条GO富集分析结果，其中包含88项生物过程条目，40项细胞成分条目，34项分子功能条目。图 4展示了各部分校正后P值最高的15条通路。各个部分颜色不同。横向坐标代表校正后的P值，校正后P值越高，说明基因在通路富集程度越大。其中，最具有代表性的是生物进程条目，涉及凋亡过程的负向调节(Negative regulation of apoptotic process)、信号转导(Signal transduction)和蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation)等生物学过程。

经校正P＜0.05筛选后，共得到107条KEGG信号通路结果。校正后P值排名前15的通路结果如图 5所示，主要有：缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、磷脂酶D信号通路(Phospholipase D signaling pathway)、神经营养素信号通路(Neurotrophin signaling pathway)等。横轴表示Gene ratio，表示KEGG通路中所含的基因数目占所有基因的百分比；纵坐标表示路径名称；气泡大小代表着富集的基因数目；纵轴展示通路名称；气泡尺寸表示富集基因的数量，其大小与富集基因数呈整正相关；以不同色彩代表P值，气泡颜色随P值依次渐变。其中，ErbB信号通路高度值hub基因富集程度最高，可能是最重要的信号通路(见图 6)。

2.4 分子对接结果

分子对接结果显示(见图 7)，槲皮素与SRC、MTOR、EGFR、AKT1、PTK2分子对接LibDockSccore值依次为95.718 8、97.583 3、77.993 5、114.16、93.314 5，对接评分均较高，说明槲皮素与这些靶标具有良好的结合能力。

3 讨论

本研究的主要目的是探析槲皮素治疗抑郁的潜在机制。网络药理学结果表明，SRC、AKT1和mTOR可能是槲皮素改善抑郁症的关键作用靶点。以往研究表明，LPS注射可导致小鼠神经炎症和抑郁样行为。LPS注射组小鼠脑组织中SRC-1表达降低，提示SRC-1在炎症和抑郁中的作用^[13]。pCREB影响海马突触可塑性和空间记忆功能，它的表达减少与阿尔茨海默症的学习和记忆受损有关。体外实验中，SRC-1敲低显著降低了pCREB表达水平^[14]。神经炎症可以诱导神经元再生，使神经营养因子释放减少，导致神经活动失调，并有助于抑郁症的发展^[15]。有研究证实，PI3K / Akt通路的激活诱导NF-κB的磷酸化，这导致大脑区域的神经炎症，并有助于啮齿动物抑郁样行为的发展^[16]。PI3K / Akt / NF-κB通路也能在新生儿母体剥夺和慢性轻度应激的抑郁模型中被激活^[17]。mTOR作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶^[18]，可通过p70S6激酶的磷酸化和哺乳动物eIF4E结合蛋白(4EBP)的抑制来调节神经发生、树突状脊柱生长和蛋白质翻译启动，从而合成神经元突触所需的蛋白质^[18-19]。这与目前抗抑郁药的作用机制一致，即通过促使神经突触再生，从而达到抗抑郁的目的。这些发现与我们的结果一致。因此我们推测槲皮素可能通过作用于SRC、AKT1和mTOR产生抗抑郁效应。

KEGG通路富集分析结果显示，槲皮素治疗抑郁可能与HIF-1信号通路、ErbB信号通路等多条通路密切相关。HIF-1是一种由α、β两种亚基构成的转录因子，能对缺氧作出反应。已有研究表明，HIF-1通路激活的显着增加导致脑源性神经营养因子(BDNF)的持续表达^[20]。BDNF广泛存在于中枢神经系统，在海马、皮质中大量表达，并参与神经元功能的维持、发育以及神经元受损后的修复，从而产生抗抑郁药样效应^[21]。以上结果提示激活HIF-1信号传导可在槲皮素治疗抑郁中发挥重要作用。神经调节素-1(NRG1)是精神分裂症，双相情感障碍等多种精神疾病的易感基因，对皮质神经元、运动神经元、多巴胺能神经元、耳蜗感觉神经元和PC12细胞具有神经保护作用^[22]。NRG1相关通路的异常改变与抑郁症的发生密切相关。Bi等人发现，阻断NRG1-ErbB4信号传导增强了焦虑样行为^[23]。NRG/ErbB信号传导改变后，转基因小鼠出现异常行为以及学习记忆缺陷。因此，综合既往文献及本研究结果，推测槲皮素可能通过调控HIF-1、NRG/ErbB等多条信号通路来维持神经元功能和发育，从而发产生抗抑郁效应。

目前已有研究仅说明槲皮素可改善抑郁样行为，并未对其具体机制进行研究。本研究利用网络药理学方法，发现了槲皮素治疗抑郁的潜在靶点及通路，为设计和开发新的有效抗抑郁药物奠定基础。但本研究也存在一定局限性。首先，研究所使用的数据库数据覆盖范围有限，不包含未经证实和未记录的化合物或靶标。其次，分子对接本质上属于计算机预测技术，无法完全代替动物实验。因此，研究结果需在动物模型中进行进一步验证。

4 结论

研究以网络药理学方法为指导，利用分子对接技术，对槲皮素-抑郁的关键靶点进行验证，发现槲皮素对抑郁的作用主要涉及SRC、AKT1、mTOR等靶点，HIF-1、NRG/ErbB等信号通路，提示槲皮素的抗抑郁机制可能是促进神经突触再生、改善脑肠轴功能以维持神经系统正常功能。