2023, Vol. 21
目前，在已知致病基因中约一半的变异为单核苷酸变异(Single-nucleotide Variants, SNVs)[1]，这意味着开发高效校正SNVs的方法，具有广泛的科学研究价值和遗传病基因治疗潜力。CRISPR/Cas9系统是目前广泛应用的基因编辑工具之一，但其主要通过切割DNA双链，借助细胞中DNA双链断裂修复机制来编辑基因，难以精确校正单个核苷酸位点的突变。单碱基编辑系统(Base Editor, BE)是在CRISPR/Cas9系统的基础上开发得到的新型碱基编辑工具，主要有胞嘧啶碱基编辑器(C to T)和腺嘌呤碱基编辑器(A to G)两类。单碱基编辑系统能够实现单核苷酸水平的精准突变，其不但具有高效性和特异性，并且在细胞、小鼠模型和植物的基因组中产生插入缺失的比例一般低于1%[2-5]。因此，单碱基编辑系统在研究等位基因位点对基因功能影响，SNV相关遗传病的致病机制和治疗方案等方面具有独特优势。
影响单碱基编辑系统编辑效率的因素包括靶基因的选择、sgRNA序列设计、脱靶效应和单碱基编辑系统向细胞内的递送方式等，sgRNA序列设计是其中的关键因素之一[6]。有研究报道，sgRNA序列活性与Cas9蛋白序列偏好性[7-9]，以及脱氨酶的序列偏好性[5, 10-12]有着密切联系。此外，若基因组上存在与设计的sgRNA序列相似度较高的片段，容易发生脱靶效应，在基因组靶位点之外产生编辑。因此，优化sgRNA设计有助于提高编辑效率，降低脱靶情况的发生。
sgRNA设计工具的实现方式主要有三大类：一是基于序列比对的方法，即sgRNA和基因组的比对结果；二是基于概率假设的方法，即利用sgRNA上的一些特征(如GC含量)进行设计；三是基于学习的方法，利用大型数据集训练机器学习和深度学习模型来设计sgRNA。目前针对单碱基编辑系统的sgRNA设计工具主要基于序列比对和sgRNA序列特征，且无法预测编辑效率。
本研究使用Song等人[13]发表的高通量单碱基编辑系统测序数据，利用卷积神经网络(Convolutional Neural Network，CNN)模型，结合Cas-OFFinder脱靶位点预测工具[14]，开发了一个sgRNA序列设计工具BEguider。该工具能针对人基因序列进行sgRNA设计、靶向编辑效率预测以及寻找sgRNA在基因组上可能的脱靶位点。
1 数据与方法 1.1 数据本研究中，单碱基编辑器BE4-NGG和ABE7.10-NGG的CNN模型的训练数据来自于Song等人[13]发表的高通量外源递送系统测序数据。数据被划分为训练集，验证集和测试集，比例为8∶1∶1。
内源性位点数据来自于NCBI BioProject数据库的公开项目PRJNA476544。
人类hg38参考基因组序列来自于Ensembl数据库。
1.2 方法 1.2.1 BEguider分析预测流程首先，对输入的基因序列进行预处理，筛选候选sgRNA序列。分别在输入基因上的正链与负链上寻找是否存在NGG PAM序列。定位到NGG PAM序列后，向序列5’方向搜索，寻找编辑活性窗口内(即sgRNA第4到8位碱基)是否存在可编辑的底物核苷酸——A或C。若存在，则提取PAM序列前的20 nt核苷酸序列与4 nt PAM序列作为候选sgRNA序列。
其次，对于候选的sgRNA进行独热编码(One-hot Encoding)。为了使计算机能够识别并处理sgRNA序列，需要对每条序列进行独热编码，碱基A用向量[1, 0, 0, 0]表示，碱基C用向量[0, 1, 0, 0]表示，碱基G用向量[0, 0, 1, 0]表示，碱基T用向量[0, 0, 0, 1]表示。因此，每条长为L nt的sgRNA的序列可以被表示为一个L×4的矩阵Xinput∈RL×4。
最后，对候选sgRNA序列的编辑效率进行预测并输出。CNN模型优势在于能够很好地学习训练样本的局部特征，达到准确的预测效果。神经网络会对输入的每个sgRNA独热编码矩阵进行预测分析，经过两层二维卷积层与两层全连接层处理，输出对应的预测概率(见表 1)。在卷积层与全连接层之间，以及两层全连接层之间各有一层随机失活层，随机失活比例为0.3，防止CNN在较小的数据集上发生过拟合现象。
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表 1 BEguider中的卷积神经网络结构 Table 1 CNN structure of BEguider |
CNN模型的评价指标有均方误差MSE，Pearson相关系数，Spearman相关系数。
全流程如图 1c所示。
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图 1 单碱基编辑器编辑示意图与BEguider工作流程图 Figure 1 Editing process of base editors and the workflow of BEguider 注：(a) ABE将腺嘌呤脱氨得到次黄嘌呤，细胞内DNA复制时次黄嘌呤会与胞嘧啶配对，经DNA复制，A: T配对被替换为G: C配对；(b) CBE将胞嘧啶脱氨得到尿嘧啶，细胞内DNA复制时尿嘧啶会与腺嘌呤配对，经DNA复制，C: G配对被替换为T: A配对(浅绿色为Cas9n核酸酶，淡橘色为DNA脱氨酶，浅灰色为尿嘧啶糖基化酶抑制剂，土黄色为DNA上的PAM序列，红色为点突变位点，蓝色为sgRNA序列，紫色为新合成的DNA双链)；(c) sgRNA a，sgRNA b和sgRNA c表示针对同一个基因位点可以设计多条sgRNA。 |
BEguider的代码已上传至gitee仓库，可通过git clone命令下载。使用BEguider前，需要预先安装运行依赖的深度学习框架TensorFlow 2与第三方python程序包，建议通过开源软件包管理系统Conda进行安装(requirements_BEguider.txt已在软件中提供)。命令如下：
git clone https://gitee.com/gaojingjing123/beguider
conda create --name＜env＞--file requirements_BEguider.txt
BEguider支持三种输入形式(见图 2)：
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图 2 BEguider的命令行截图说明 Figure 2 Screenshot for commands of BEguider |
(1) 输入基因名或序列ID与对应的基因序列。
(2) 输入靶位点所在的染色体号与染色体坐标。
(3) 输入靶位点的rsID。
对于ABE7.10-NGG和BE4-NGG，BEguider支持两种sgRNA设计模式(见图 2)：
(1) 指定单碱基编辑器模式：输入编辑器名称，指定ABE7.10-NGG或BE4-NGG作为编辑工具。
(2) ALL模式：BEguider给出最佳的单碱基编辑器与sgRNA组合。
BEguider整合Cas-OFFinder脱靶位点搜索工具，提供可选的预测脱靶位点功能。
1.2.3 BEguider在内源性位点的预测效果评估将内源性sgRNA序列输入BEguider，得到预测编辑效率，用Pearson相关系数和Spearman相关系数评估预测编辑效率与实验编辑效率之间的相关性。其中，ABE7.10-NGG的sgRNA序列有94条，BE4-NGG的sgRNA序列有102条。
2 结果 2.1 BEguider神经网络模型训练结果BEguider的训练数据来自于外源靶序列，即慢病毒将靶序列整合进宿主细胞基因组，再由单碱基编辑器对靶位点编辑，最后PCR扩增出靶位点片段进行高通量测序获得编辑结果。BEguider中包括两个CNN模型，分别为ABE7.10-NGG和BE4-NGG提供预测功能。图 3为BEguider在训练集与验证集上MSE随训练轮次的变化。在模型训练过程中验证集的数据特征可能会泄露到模型中，因此模型评价需要在模型从未接触的测试集数据中进行。在测试集中ABE7.10-NGG的MES为0.007 8，Spearman相关系数为0.901 3，Pearson相关系数为0.904 5(见图 4a)；BE4-NGG的MES为0.001 9，Spearman相关系数为0.853 1，Pearson相关系数为0.867 3(见图 4b)。这说明BEguider能够较好地预测未知sgRNA的编辑效率。
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图 3 BEguider训练集与验证集上的MSE Figure 3 MSE of BEguider on training set and validation set 注：(a)、(b) 横坐标表示训练轮次，纵坐标表示每个轮次结束计算的MSE |
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图 4 BEguider在测试集上预测结果与测序结果的相关性 Figure 4 Correlation between predicted efficiencies of BEguider and measured efficiencies on the test set 注：(a)、(b) 横坐标表示测序得到的编辑效率，纵坐标表示BEguider预测的编辑效率。N为纳入评估的sgRNA的数量，R为Spearman相关系数，r为Pearson相关系数. |
为了扩大BEguider的应用范围，需要评估BEguider对内源基因组位点编辑效率预测的效果。对于ABE7.10-NGG，BEguider的预测编辑效率与实验编辑效率的Spearman相关系数0.827 6，Pearson相关系数为0.852，MSE为0.021(见图 5a)。对于BE4-NGG，BEguider的预测编辑效率与实验编辑效率的Spearman相关系数0.703 2，Pearson相关系数为0.636 3，MSE为0.026 4(见图 5b)。说明BEguider能够准确提取sgRNA序列特征，建立sgRNA序列组成与编辑效率之间的联系，对于内源性位点的编辑效率也有较好的预测效果。
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图 5 BEguider对内源性位点预测编辑效率的效果评估 Figure 5 Evaluation of the predictive performance of BEguider at endogenous sites 注：N为纳入评估的内源性位点数量，R为Spearman相关系数，r为Pearson相关系数。 |
以输入形式为rsID为例，选取10个SNV位点，将rsID输入BEguider，使用推荐单碱基编辑器与sgRNA组合的模式，默认不开启脱靶位点预测，在linux系统中运行命令如下：
python BEguider.py -s SNP_example.txt -b ALL -o./temp。
BEguider一共设计出12条sgRNA，输出信息包括单碱基编辑器、SNV的相关信息、sgRNA所在的正负链情况、设计的sgRNA序列以及对应的预测编辑效率。结果如表 2所示。
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表 2 以10个SNV位点为例的sgRNA设计结果 Table 2 Output results of sgRNAs for ten SNVs using BEguider |
将BEguider与5种目前可用的碱基编辑设计工具进行比较(见表 3)。Benchling、BE-Designer和beditor主要功能是在指定的单碱基编辑器与点突变上给出编辑结果，而BEable-GPS、BE-FF能找到合适的碱基编辑器来还原给定点突变的变化。BEguider的优势在于提供了靶序列的多种输入方式，能够根据需要选择编辑野生型基因位点或突变型基因位点，同时批量为多个基因位点设计sgRNA，预测每条sgRNA的编辑效率。
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表 3 多个sgRNA设计工具的比较 Table 3 Comparison of different sgRNA design tools |
传统的基因编辑工具，如锌指蛋白核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)，转录激活样效应因子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)等，需要通过改造蛋白结构域才能在新的靶位点进行编辑，过程复杂，而单碱基编辑系统仅需要合成新sgRNA序列即可靶向新的基因位点，因此单碱基编辑系统的高效性、精确性、稳定性和易操作性，使其成为目前最为流行的基因编辑工具之一。
单碱基编辑系统提高了在细胞内功能性SNVs位点筛选与验证的效率，为SNV相关疾病的机制研究和治疗方案的探索提供了新工具和新方法。例如，Weng等人[19]利用单碱基编辑系统从染色体17q21上136个SNVs位点中筛选到了功能SNP位点rs12603332。在肠类器官中，ABE能够校正与囊肿性纤维化高度相关的CFTR基因的无义突变，编辑效率最高为9.3%[20]。在小鼠模型中，CBE能够校正致聋基因TMC1的点突变，编辑效率最高为51%[21]。
具有高活性的sgRNA序列是使用单碱基编辑器进行研究的基础。BEguider利用CNN神经网络，学习了大量单碱基编辑器序列偏好特征与sgRNA编辑活性的序列特征，能够准确预测所设计的sgRNA编辑活性。此外，对于由其它支持ABE7.10-NGG和BE4-NGG sgRNA序列设计工具得到的sgRNA序列，只要将其整理为BEguider要求的输入格式，也可输入BEguider进行编辑效率预测与脱靶情况评估。
目前，BEguider还存在一定局限性。由于数据集的限制，BEguider仅支持ABE7.10-NGG和BE4-NGG的sgRNA设计，且只能设计PAM序列为NGG的sgRNA。此外，以染色体坐标或rsID作为输入时，BEguider需在线从NCBI获取数据，因此在设计大量SNVs时运行速度会受到网速、NCBI响应速度等因素的限制。未来，BEguider将继续整合更多类型的单碱基编辑器数据，为用户提供更多单碱基编辑器的选择，并且继续优化提高sgRNA设计效率。
4 结论本研究利用CNN模型，开发了针对ABE7.10-NGG和BE4-NGG的sgRNA序列设计工具BEguider，支持Windows、Linux和MacOS操作系统。BEguider能够同时为多个人类基因位点设计sgRNA，并提供3种输入格式，2种设计模式与可选的脱靶评估功能。用户可以指定ABE7.10-NGG或BE4-NGG，也可由BEguider提供最佳的单碱基编辑器与sgRNA序列组合，并给出预测的编辑效率。BEguider能够大大简化sgRNA的设计流程。随着单碱基编辑器的应用越来越广泛，简便有效的sgRNA设计方案能够有利于提高实验效率，帮助研究人员更好地利用单碱基编辑器作为研究工具。
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