2022, Vol. 20
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate或Urethane，简称EC)，存在于多种发酵食品和酒精饮料中，是一种具有致癌性的物质[1-2]。2007年，EC被国际癌症研究机构IARC(the International Agency for Rescarch on Cancer)归类为2A类致癌物质[3]。日本、加拿大等[4-5]国家对酒精饮料中EC含量有着严格的限量标准。目前消除EC有多种方法，包括对发酵工艺的优化、物理吸附、代谢工程改造酵母以及生物酶法消除等，其中用生物酶法来消除EC被认为是最为理想的一种方法[6]。关于消除EC的生物酶研究中，用于EC消除的酶有两种，一种是酸性脲酶(Acid urease)；另外一种就是氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase或urethanase)。1990年，Kobashi[7]等日本学者从小鼠肠道中的Citrobacter sp.中第一次发现EC水解酶，证实其能够降解EC。2006年，Akutsu-ShigenoY[8]等从马红球菌(Rhodococcus equistrain TB-60)中得到了EC水解酶，并实现了该酶的异源表达。李京京[9]等从小鼠的胃中筛选出一株具有EC降解能力的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02，并通过对其蛋白质的N段测序，获得了该酶的氨基酸序列。EC水解酶存在于多种微生物中，并且不同微生物的EC水解酶的酶学性质差异较大，普遍存在对乙醇和酸的耐受力差、对底物的亲和力低的问题[8, 10]。2016年，刘晓慧[11]等人通过计算机辅助以及定向改造技术对来自于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶进行改造，提高了该酶的温度稳定性，但其对乙醇的耐受力并未有所提升。此外，EC水解酶的氨基酸序列未得到有效解析。2019年，Masaki [12]等日本学者在假丝酵母Candida parapsilosis得到了EC水解酶，并获得了该酶的基因序列。目前，已报道的EC水解酶均属于酰胺酶家族，从EC分子的结构上来看，酯酶家族部分酶也能够对其进行水解，但是还未见有酯酶降解EC的报道[6](见图 1)。EC水解酶存在的这些问题限制了EC水解酶的发展与应用。若采用基因工程以及蛋白质工程的手段，对EC水解酶进行分析优化等研究，解决其存在的问题，可进一步推进EC水解酶在食品中的应用。
本研究采用生物信息学的方法对EC水解酶进行分析，结合ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0 Server、NetPhos 2.0 Server等生物信息学软件，对微生物的EC水解酶氨基酸序列分别进行理化性质、序列分子进化、亲水或疏水性、二级结构、功能域、信号肽以及蛋白的磷酸化等方面进行分析和预测，为下一步EC水解酶的酶分子改造、基因工程菌的构建、表达等奠定基础。
1 材料与方法 1.1 数据来源试验中的EC水解酶(UH)序列均来自美国国家生物信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已收录的完整的氨基酸序列，分别来自于马红球菌、赖氨酸芽孢杆菌以及假丝酵母(见表 1)。
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表 1 氨基酸序列基本信息 Table 1 Basic information of amino acid sequence |
采用Expasy网站提供的ProtParam工具对EC水解酶的氨基酸序列进行理化性质分析；亲疏水性特征使用Expasy网站的ProtScale工具进行分析；使用在线工具NPSA server中的SOPMA进行微EC水解酶的氨基酸序列二级结构分析和预测[13]；使用CDD和SMART[14]对EC水解酶保守结构的分析；EC水解酶信号肽的分析和预测采用工具SignalP 5.0 server；运用TMHMM 2.0 Server进行EC水解酶的跨膜结构域的分析和预测；NetPhosK 3.1 Server进行EC水解酶的氨基酸序列磷酸化位点分析；使用SWISS-MODEL[15]和I-TASSER对EC水解酶进行3D建模，以及使用SAVES[16]对模型进行评价。利用Clustal Omega[17]进行氨基酸的多序列比对分析，并用ESPript3.0进行序列对比的结果显示。在线分析工具网址(见表 2)。
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表 2 生物学在线分析工具网址 Table 2 Websites of online biology analysis tools |
使用ProtParam工具分析3条完整的EC水解酶蛋白序列(见表 3)。结果显示，目前在NCBI上所能检索到的EC水解酶氨基酸序列中，氨基酸数量在472-551之间，氨基酸数量最大的是假丝酵母，为551 aa，分子量为61.74 kDa左右。理论等电点(pI)范围在5.03~5.71之间，最大的为Candida parapsilosis。三个蛋白的负电荷氨基酸残基总数(Asp + Glu)都大于正电荷氨基酸残基总数(Arg + Lys)。同时对三个EC水解酶的氨基酸残基组成也进行了分析(见表 4)。发现3个EC水解酶蛋白共有的且含量丰富的主要氨基酸为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)。在蛋白质稳定性方面，Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶不稳定指数为34.70，显示为较稳定蛋白，其余两种蛋白为不稳定蛋白。此外，脂肪系数的结果显示，3个蛋白均表现为亲水性。
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表 3 EC水解酶的氨基酸序列理化性质 Table 3 Physicochemical properties of amino acid sequence of urethane hydrolase |
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表 4 EC水解酶家族成员氨基酸组成成分分析 Table 4 Analysis of amino acid composition of members of urethane hydrolase family |
经过ProtScale对EC水解酶氨基酸序列进行亲水性/疏水性预测。Hphob. /Kyte & Doolittle量表规定疏水性越强的氨基酸标度值越高，当蛋白质的氨基酸标度值大于0时为疏水，小于0时为亲水。
在亲疏性分析中，马红球菌Rhodococcus equistrain TB-60的多肽链中465位Trp的值为-2.156，亲水性最强，第283位Cys的值为2.089，疏水性最强(见图 2a)；赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的多肽链中第463位Asn的值是-3.344，是最低分，亲水性最强，第229位Leu值是1.978，为最高分，疏水性最强(见图 2b)；假丝酵母Candida parapsilosis的多肽链中第324位Pro的值为-3.244，亲水性最强，第453位Val的值为2.156，疏水性最强(见图 2c)；且在亲疏水性分析中三种微生物的EC水解酶都属于亲水性蛋白。
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图 2 EC水解酶的亲/疏水性分析 Figure 2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of urethane hydrolase |
利用SignalP 5.0 server对三株菌的EC水解酶的氨基酸序列进行信号肽分析，都表示EC水解酶的氨基酸序列不含有信号肽(见图 3)。
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图 3 EC水解酶信号肽预测 Figure 3 Signal peptide prediction of urethane hydrolase |
利用在线工具TMHMM 2.0 Server对三株菌的EC水解酶的跨膜区进行分析及预测，3株菌的EC水解酶在膜内的概率为0，在膜外的概率为100%(见图 4)，说明EC水解酶不存在跨膜结构域。
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图 4 EC水解酶跨膜结构域预测 Figure 4 Prediction of transmembrane domain of urethane hydrolase |
磷酸化作为蛋白质翻译后的修饰之一，在细胞的信号转导中起着重要的作用[18]。蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中具有游离羟基的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基本身不带电荷，当磷酸化作用后，便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化。通过在线软件NetPhosK 3.1 Server对EC水解酶的氨基酸序列进行预测。EC水解酶氨基酸序列磷酸化位点(见表 5)。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶中含有15个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点、6个酪氨酸位点；Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶中含有23个丝氨酸位点、11个苏氨酸位点、7个酪氨酸位点；Candida parapsilosis的EC水解酶中含有30个丝氨酸位点、16个苏氨酸位点、12个酪氨酸位点。
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表 5 EC水解酶氨基酸序列磷酸化位点统计 Table 5 Statistics of phosphorylation sites of amino acid sequence of urethane hydrolase |
蛋白的二级结构一般由α-螺旋、β-链、β-转角和无规则卷曲等结构原件组成[19]。通过SOPMA在线工具对3株菌的EC水解酶的二级结构进行预测，结果(见图 5)。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶中α-螺旋占41.53%，延伸链占7.63%，β-转角占3.39%，无规则卷曲占47.46%；Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶中α-螺旋占48.09%，延伸链占10.59%，β-转角占3.6%，无规则卷曲占37.71%；Candida parapsilosis的EC水解酶中α-螺旋占39.34%，延伸链占11.07%，β-转角占3.45%，无规则卷曲占46.10%。
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图 5 EC水解酶二级结构的预测 Figure 5 Prediction of secondary structure of urethane hydrolase 注：蓝色代表α-螺旋; 绿色代表β-转角; 红色代表延伸链; 紫色代表无规则卷曲. |
通过CDD和SMART对EC水解酶的保守结构域分析得出，来自于三种不同菌的EC水解酶都含有与酰胺酶家族相同的Amidase结构域(见图 6)。
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图 6 EC水解酶结构域分析 Figure 6 Urethane hydrolase domain analysis |
在NCBI上检索到的完整的EC水解酶的氨基酸序列有3条。利用NCBI上的blastp功能在蛋白质PDB数据库中分别获得与现存的EC水解酶序列相似度最高的氨基酸序列。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶氨基酸序列与Bacterium CSBL00001的芳基酰基酰胺酶(PBD：4YJ1_A)同源性最高，为33.81%。Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶氨基酸序列与Pseudomonas aeruginosa PAO1的谷氨酰胺基转移酶A亚基(PDB：4WJ3_A)同源性最高，为39.47%。Candida parapsilosis的EC水解酶氨基酸序列与Rattus norvegicus的脂肪酸酰胺水解酶(PBD: 1MT5_A)同源性最高，为27.98%。由于使用SWISS-MODEL进行建模时，同源序列要大于30%，故对Candida parapsilosis的EC水解酶进行建模时，使用I-TASSER。预测得到的三维结构中(见图 7a、7b、7c)，α-螺旋用红色表示，β-折叠用黄色表示，绿色为无规则卷曲，总体来看，EC水解酶的三维结构均以α-螺旋以及无规则卷曲为主，这预测结果与二级结构预测相对应。
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图 7 EC水解酶三维结构模型与拉氏构象图 Figure 7 Three-dimensional structure model and Ramachandran plot of urethane hydrolase |
使用在线软件SAVES中的Verify_3D以及拉氏构象图对模型进行评价。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶的Verify_3D评分为87.80%；Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶的Verify_3D评分为89.44%；Candida parapsilosis的EC水解酶的Verify_3D评分为84.39%。
拉氏构象图简称拉氏图(Ramachandran Plot)，其作用是体现出氨基酸残基在拉氏图中的区域分布。拉氏构象图分为四个区，红色区域是最合适区域，该区域内氨基酸数目越多，则表示该蛋白模型的骨架结构越合理；黄色区域是允许区域；浅黄色区域是最大允许区；而白色区域是不允许区，该区域氨基酸的构象是不合理的。从图 7a、7b、7c可知使用SWISS-MODEL以及I-TASSER所建的EC水解酶模型，处于允许区的氨基酸残基都大于90%，并且不允许区都小于5%。
2.8 蛋白质多序列比对分析利用在线软件Clustal Omega中的多序列比对功能对3个EC水解酶与Bacterium CSBL00001的芳基酰基酰胺酶的氨基酸序列进行比对(见图 8)。三个EC水解酶的序列相似度为29.17%。来自于真菌Candida parapsilosis的EC水解酶氨基酸序列与两个来源于细菌的相似度较低，与Rhodococcus equistrain TB-60序列相似度为14.49%，与Lysinibacillus fusiformis SC02序列相似度为15.22%，而来源于细菌的两菌株氨基酸序列相似度为31.3%。从图中可见位于160位左右的氨基酸残基保守性较强，特别是GGSSGG，这些氨基酸残基在酰胺酶进化过程中具有较强的保守性。
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图 8 EC水解酶的多序列比对结果 Figure 8 Results of multiple sequence alignment of urethane hydrolase |
EC作为2A类致癌物质，广泛存在于酒精饮料等发酵食品中。应用微生物酶法去消除EC具有直接、高效的特点。EC水解酶有三个完整的氨基酸序列得以鉴定，且所发现的EC水解酶在酸性或者乙醇存在条件下不稳定，不能在酒精饮料中得到广泛的应用。如果能利用分子生物学的手段对EC水解酶进行改造，使其能被应用于食品生产过程中，降低食品中EC的浓度，具有重要意义。
生物信息学作为一门交叉学科，利用数学、计算机科学、生命科学技术理论和工具，在生物科学领域的信息获取、加工、储存、分析等方面发挥着重要的作用。本研究利用生物信息学相关方法，在NCBI中查找到三条完整编码EC水解酶的基因序列，对其编码的氨基酸序列组成、基本理化性质进行分析，通过软件预测蛋白的亲疏水性、信号肽、跨膜域，更进一步预测了蛋白的二级以及三维结构。结果表明，三个蛋白序列都具有与酰胺酶家族相同的Amidase保守结构域，证明了目前已公布的EC水解酶都是酰胺酶，与刘庆涛所说的一致[6]。使用计算机进行分析蛋白质的稳定性时，蛋白质的不稳定系数是一个重要的表征。不稳定指数是对蛋白质在实验中的稳定性评估，当蛋白质的不稳定系数大于40时，推测该蛋白质为不稳定蛋白，当小于40时为稳定蛋白[20]。氨基酸序列理化性质分析表明，除Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶为较稳定蛋白，其余两种蛋白均表现为不稳定蛋白。在蛋白质中，氨基酸之间的亲/疏水性相互作用是形成其三级结构最重要作用力之一，亲疏水作用可以驱使蛋白质进行折叠，有利于蛋白质三级结构的稳定。亲疏水性预测结果显示，三个EC水解酶蛋白均属于亲水性蛋白。对蛋白的信号肽以及跨膜域分析表明，三株菌的EC水解酶都不含有跨膜域以及信号肽。蛋白质二级结构预测发现，EC水解酶都以α-螺旋、无规则卷曲为主。蛋白质空间结构预测，对其结构与功能的研究具有较为重要意义[21]。本研究通过同源建模的方式得到了EC水解酶的三维结构，除对Candida parapsilosis的EC水解酶进行建模时，使用I-TASSER，其余两种均使用SWISS-MODEL进行建模。三维结构模型的合理性通过Verify_3D以及Ramachandran Plot进行验证。Verify_3D用于评估模型的三维结构与氨基酸一级序列结构的相容性，检测氨基酸侧链构象的合理性，SAVES获得的评分≥80%，表明侧链构象合理[22]。三个蛋白的三维结构的Verify_3D评分都大于80%，说明侧链构象合理。在Ramachandran Plot中，模型评价要求处于允许区的氨基酸大于90%，如果二面角中有高于90%的都位于一般允许区，则可表明其空间结构具有一定的稳定性[23-24]。三个蛋白质三维结构模型中处于允许区的氨基酸均大于90%，表明模型中所有氨基酸均形成了一个合理的二面角稳定构型。
4 结论1) EC水解酶基因编码472~551 aa，分子量在50~62 kD之间，理论等电点(pI)在5左右，均为酸性亲水性蛋白；
2) 目前EC水解酶无跨膜区和信号肽；
3) 二级结构预测结果显示EC水解酶的氨基酸都以α螺旋以及无规则卷曲为主，螺旋与折叠排列有序；
4) 目前发现的EC水解酶均属于酰胺酶家族；
5) 对EC水解酶进行三维模型的构建，预测结果质量评估均较好，并使用同源比对的方法，分析出EC水解酶高保守氨基酸残基。利用生物信息学相关软件对EC水解酶蛋白进行预测和分析，为挖掘新的EC水解酶、进一步研究EC与EC水解酶结合位点以及对EC水解酶的改造提供了理论依据。
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