生物信息学  2019, Vol. 17 Issue (1): 45-52  DOI: 10.12113/j.issn.1672-5565.201804005
0

引用本文 

付伟, 谢东, 班春梅, 邓亚婕, 代芳, 王松, 曹洁. 幽门螺杆菌感染胃组织基因芯片生物信息学分析[J]. 生物信息学, 2019, 17(1): 45-52. DOI: 10.12113/j.issn.1672-5565.201804005.
FU Wei, XIE Dong, BAN Chunmei, DENG Yajie, DAI Fang, WANG Song, CAO Jie. Bioinformatics analysis of Helicobacter pylori infected gastric tissue microarray[J]. Chinese Journal of Bioinformatics, 2019, 17(1): 45-52. DOI: 10.12113/j.issn.1672-5565.201804005.

基金项目

解放军联勤保障部队第925医院院内课题(No.YNKT2016-01)

作者简介

付伟, 男, 博士, 研究方向:生物信息学, 肿瘤.E-mail:Fmmufw@Foxmail.com

文章历史

收稿日期: 2018-04-19
修回日期: 2018-07-09
幽门螺杆菌感染胃组织基因芯片生物信息学分析
付伟 , 谢东 , 班春梅 , 邓亚婕 , 代芳 , 王松 , 曹洁     
解放军联勤保障部队 第925医院消化血液科,贵阳 550009
摘要: 为探讨幽门螺杆菌感染胃组织后差异基因变化,深入分析参与疾病发生、发展的分子机制。从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库下载幽门螺杆菌感染胃组织基因芯片数据(GSE5081),根据胃粘膜组织是否受损分组,分别比较幽门螺杆菌感染者与阴性对照组,获得差异基因并进行功能分析包括GO分析、信号通路分析,基因相互作用及基因共表达,得到重要核心基因,并通过实时定量PCR方法进行验证。结果表明:得到参与幽门螺杆菌感染后上调的44个主要基因,主要涉及的GO分析及信号通路包括免疫反应、炎症反应、抗原提呈、细胞因子通路、因子受体关联,细胞粘附分子等。研究发现核心基因CXCR4, CCL20, JAK3, TNFAIP2, PLEK, HLA-DMA, PTPRC, CXCL13, BCL2A1,并通过实时定量PCR的方法进行部分验证,CXCR4, CXCL5, CXCL2在幽门螺杆菌感染后的胃黏膜组织表达高于对照组。幽门螺杆菌感染后胃粘膜组织引起免疫反应,炎症反应,抗原提呈,因子受体关联,细胞粘附分子通路的激活。同时发现一些主要的趋化因子相关基因CXCR4,CXCL5,CXCL2,CCL20,CXCL1等,涉及增殖,炎症,免疫,凋亡基因JAK3,TNFAIP2,PLEKHLA-DMAPTPRCBCL2A1等的表达上调,并实时定量PCR验证部分相关基因的表达。这些结果为从分子网络机制层面上认识幽门螺杆菌感染提供分析思路及基础。
关键词: 幽门螺杆菌    基因芯片    生物信息学分析    胃黏膜组织    
Bioinformatics analysis of Helicobacter pylori infected gastric tissue microarray
FU Wei , XIE Dong , BAN Chunmei , DENG Yajie , DAI Fang , WANG Song , CAO Jie     
Department of Hematology, No.925 Hospital of PLA Joint Logistics Support Force, Guiyang 550009, China
Abstract: To analyze the differential gene changes after Helicobacter pylori (H. pylori) infection in gastric tissue, and to further analyze the molecular mechanism involved in the occurrence and development of disease, the H. pylori infected gastric tissue microarray data (GSE5081) were downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database. In addition, according to whether the gastric mucosal tissue was damaged or not, the data were divided into the H. pylori infected group and the negative control group. Comparison was made between the two groups to obtain differential genes, and functional analyses including GO analysis, analysis of signal pathways, gene interactions, and gene co-expression were carried out, which obtained important core genes and were validated by real-time quantitative PCR. Results show that 44 major genes were involved in the upregulation of H. pylori infection. The mainly involved GO analyses and signal pathways included immune response, inflammatory response, antigen presentation, cytokine pathway, factor receptor association, cell adhesion molecules, and so on. The core genes were CXCR4, CCL20, JAK3, TNFAIP2, PLEK, HLA-DMA, PTPRC, CXCL13, and BCL2A1, and were partially verified by real-time quantitative PCR methods. The gene expressions of gastric mucosa with CXCR4, CXCL5, and CXCL2 after H. pylori infections were higher than the control group. The gastric mucosal tissue infected by H. pylori induced immune response, inflammatory response, antigen presentation, factor receptor association, and cell adhesion molecule pathway activation. Meanwhile, some major chemokine-related genes CXCR4, CXCL5, CXCL2, CCL20, and CXCL1 were associated with the upregulation of proliferation, inflammation, immunity, apoptosis genes such as JAK3, TNFAIP2, PLEK, HLA-DMA, PTPRC, and BCL2A1. Real-time quantitative PCR was used to verify the expression of some related genes. The research results provide an analytical idea and basis for understanding the H. pylori infection from the perspective of molecular network mechanism.
Key Words: Helicobacter pylori    Gene microarray    Bioinformatics analysis    Gastric mucosa    

目前幽门螺杆菌感染(Helicobacter pylori,HP)已经非常常见,平均大约50%的人群有感染[1],特别是在贫困地区,因为自然环境、饮食卫生条件、及民俗习惯等感染率会更高。HP感染者可能会导致慢性活动性胃炎,糜烂性胃炎,以及消化道溃疡等消化道疾病,甚至造成食管腺癌,胃萎缩,胃癌和结直肠癌的潜在治病因素[2]。目前对于HP感染已经有多种根治治疗方案,但由于耐药菌的增多,部分患者效果较差[3]。同时一部分感染者并不是都会出现炎性改变或者癌变,为了认识HP感染对于胃粘膜组织损伤的分子机制,设计了对于HP相关芯片的生物信息学分析。

1 材料和方法 1.1 芯片数据来源

从GEO网站下载相关的基因芯片数据(GSE5081)[4]。该芯片使用微阵列比较了HP阳性和HP阴性胃糜烂和正常相邻粘膜的全基因组基因表达谱,对HP感染后mRNA表达模式进行分析。从8例HP阴性糜烂性胃窦炎患者和8例HP阳性糜烂性胃窦炎患者的冷冻活检标本中提取总RNA。同时,从所有16名患者的邻近(距离侵蚀至少3 cm)肉眼可见的正常窦腔样品取样。其中本研究涉及HP阴性患者包括三名男性患者和五名女性患者,年龄为50~88岁(中位数67.5岁)。组织学炎症程度轻度6例,中度2例。其中两人患有肠化生。本研究涉HP阳性感染者年龄为32~75岁(中位数58.5岁),5名男性和3名女性患者。组织学炎症程度轻度3例,中度1例,严重4例。其中两人有中度萎缩,一人有局灶性肠化生。在内镜检查时,没有患者接受质子泵抑制剂或抗生素治疗。所有患者属于高加索人种族。他们都没有吸烟,还有其他已知的疾病。

1.2 芯片数据生物信息分析

首先芯片的质量评估[5],通过分组差异基因的筛选[6],并功能分析、注释。把组织样本分为4组,A) ER(+)HP(+), B) ER(+)HP(-), C) ER(-)HP(+), D) ER(-)HP(-), 其中HP为幽门螺杆菌,而ER为损伤粘膜组织。分别分析受损组织,健康组织组内的HP感染与否的差异基因变化,最后合并分析。具体是A、B组进行了差异分析得到分析结果差异分析1。C、D组进行了差异分析得到分析结果差异分析2(Q值< 0.05,Fold change≥1.2,阈值设定为分析软件推荐值)。将两组获得的差异基因取并集,随后进行GO分析、通路分析,以及基因共表达网络分析,基因相互作用网络分析。

1.3 实时定量PCR验证

收集2016年1月至2016年6月,在解放军联勤保障部队第925医院C14尿素氮呼气试验阳性者(CPM>100)为感染者,检测阴性者为健康对照各10例,考虑诊断为慢性糜烂性胃炎,并且在内镜检查时,没有接受质子泵抑制剂或抗生素治疗,排除其他疾病。感染者与对照组一般临床特征无统计学差异,均取受损黏膜组织,在获取胃黏膜组织后,使用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取总RNA,然后进行反转录。cDNA被适当稀释并用于PCR。使用SYBR Premix EX Taq(TAKARA)和ABI PRISM 7300实时PCR系统(Applied Biosystems,Life Technologies,Carlsbad,CA)以β-actin作为参考对照,一式三份进行实时PCR。引物由上海生工公司合成,CXCR4引物上游:5'-CCTATGCAAGGCAGTCCATGT-3',下游:5'CCTATGCAAGGCAGTCCATGT 3',内参基因β-actin引物:上游:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA -3',下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。CXCL2上游引物:CGCAGCAGGAGCGCC下游引物: TGGATGTTCTTGAGGTGAATTCC CXCL5上游引物:GGAAGGAAATTTGTCTTGATCC下游引物: TTTCCTTGTTTCCACCGTC。参与本研究的所有HP感染患者和正常人均已签署知情同意书,并通过医院伦理委员会批准。

1.4 统计方法

差异基因筛选主要利用文献的常用方法(Significance Analysis of Microarray,SAM)。两组间计量资料采用使用T检验(平均数±SD),计数采用卡方检验,p < 0.05,有统计学差异。统计及分析软件使用spss23,以及GCBI在线实验室分析软件。

2 结果分析 2.1 芯片质量分析

总样本数量共31个。对获得的样本,首先进行质量分析,每张芯片的RLE(Relative Log Expression)计算了芯片信号值估计在整体芯片中的相对变化率,进而反映了所检测基因的变化特征。本芯片RLE一致性较高,芯片本身质量无问题(见图 1)。质量较高的芯片,才有必要进行下一步的研究分析,否则需要舍去不合格的样本。

图 1 基因芯片质量分析箱形图 Figure 1 Quality analysis box chart
2.2 差异基因筛选

应用SAM法[7]分析在预先设定的分组下筛选具有显著性差异的基因。通过分析A,B组,得到在受损的胃粘膜组织,HP(+)vs HP(-)的差异基因1,共28个(见图 2)。

图 2 A、B组差异分析1聚类分析和火山图 Figure 2 Cluster analysis chart of Group A and B, volcano map in DEG1 注:(a)中红色代表上调基因,绿色代表下调基因(颜色详见电子版http://swxxx.alljournals.cn/ch/login.aspx.(2019年第1期));(b)中横坐标代表差异倍数,纵坐标代表P值均取log

通过分析C,D组,我们得到在健康的胃粘膜组织,HP(+)vs HP(-)的差异基因(见图 3),共27个。同时两个差异基因集取并集获得上调差异基因44个。提示在HP感染后,这些基因的高表达与疾病的发生发展有关。

图 3 C、D组差异分析2聚类分析和火山图 Figure 3 Cluster analysis chart of Group C and D volcano map in DEG2
2.3 功能分析

基因功能注释的目的是发现这些差异基因在生物学功能,代谢途径中的地位和意义,研究基因表达调控网络,及其功能机制。Go分析[8]发现这些差异基因主要涉及免疫反应,炎症反应,抗原提呈,细胞间信号通路等,而KEGG信号通路分析[9],主要包括:细胞因子信号通路,因子受体相互作用,细胞粘附等通路。

2.4 核心节点基因网络分析

基因相互作用(Gene signal network)分析解构了KEGG数据库,突破限制获得单一信号通路中基因之间的相互作用。因此,可以获得一些基因的上下游分子关系。通过分析发现差异基因的相互作用:CXCR4, CCL20, CXCL13, CXCL3, CXCL5, CXCL2, HLA-DMA, HLA-DQA1, HLA-DPA1, HLA-DOA, HLA-DQB1存在有网络作用,其中核心分子为CXCR4(见图 4)。

图 4 基因相互作用网络图 Figure 4 Gene interaction network diagram

共表达网络清楚的揭示了两基因之间的关系,并找到调控网络的关键基因。这是通过基因间相关系数来拟合基因无标度网络关系实现的。分析基因共表达得到CCL20PLEKHLA-DMAJAK3BCL2A1TNFAIP2CXCL13PTPRCCXCL3FGRFAM65BC3CXCL5MMP9VNN2ADAMDEC1GZMK, TLR10之间共表达关系,其中重要的节点分子为CCL20JAK3TNFAIP2PLEKHLA-DMAPTPRCCXCL13BCL2A1(见图 5)。

图 5 基因共表达分析网络图 Figure 5 Gene co-expression network diagram
2.5 实时定量PCR验证相关基因表达

通过实施定量PCR方法,验证在感染后的胃黏膜组织部分相关基因的表达情况。研究发现CXCR4, CXCL5, CXCL2在HP阳性的胃黏膜组织表达高于HP阴性对照组,且具有统计学意义(P < 0.05)(见图 6)。

图 6 实时定量PCR检测CXCR4, CXCL5, CXCL2在胃黏膜组织中的表达(*提示P < 0.05) Figure 6 Real-time quantitative PCR detection of CXCR4, CXCL5, and CXCL2 expression in gastric mucosa
表 1 主要涉及GO基因分类(前10) Table 1 Top 10 GO mainly involved gene classification
表 2 主要涉及的信号通路(前10) Table 2 Top 10 mainly involved signaling pathway
3 讨论

幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性细菌,最初是由Warren和Marshall于1983在胃上皮的管腔表面发现,并分离出来,从第一次发现幽门螺杆菌,研究其与临床消化道疾病关系以来,已经经历三十多年[10]。绝大多数HP感染患者不会有任何临床意义上的表现,仅仅在部分患者当作引起消化道疾病治病因素,其中毒力因子空泡毒素(VacA)[11],细胞毒素相关基因A (CagA)[12]被认为是重要的治病因素。为了认识该细菌,以及了解其致病机制,做了许多研究,包括体内以及体外研究。

目前发现幽门螺杆菌与消化道疾病关系紧密,但同时与心血管疾病,贫血,脑梗,糖尿病等疾病均有关联[13-16]。为了进一步认识幽门螺杆菌对胃粘膜组织的分子层面影响,分析幽门螺杆菌相关芯片。Go分析:主要涉及免疫反应,炎症反应,抗原提呈,细胞信号通路等。Pathways通路分析:提示主要涉及的信号通路包括:细胞因子通路,因子受体关联,细胞粘附分子等。

基因相互作用分析中发现重要的CXCR4基因,与趋化因子的互相作用,在人类发育、免疫应答、癌转移均起到了重要的作用。已经有临床研究证明CXCR4在HP患者当中高表达[17],部分的HP感染患者可能会引起消化道肿瘤,CXCR4与消化道肿瘤的高表达有关系[18],这是否和CXCR4的过度激活有关?同时在已有研究中发现胃淋巴瘤观察到CXCR4和Ki-67表达之间的相关性,并提示CXCR4可作为诊断和治疗MALT型胃淋巴瘤潜在靶点[19]。不仅如此,近年来研究表明在慢性幽门螺杆菌感染过程中,骨髓间充质干细胞迁移到胃组织,也可能是胃腺癌的起源[20]

基因共表达分析中重要的节点分子为趋化因子CCL20[21]CXCL13[22]CXCL5[23]CXCL2[24]以及其他包括增殖,炎症,免疫,凋亡相关重要分子JAK3, TNFAIP2, PLEK, HLA-DMA, PTPRC, BCL2A1的激活,而这些基因与胃癌的发生发展有密切关系[25-28]。有研究证实幽门螺杆菌诱导的STAT3激活直接上调JAK3,可能有助于胃癌的发生和发展[25]。为了进一步验证分析相关分子的表达情况,进行了实时定量PCR实验验证,CXCR4,CXCL5,CXCL2在幽门螺杆菌感染后的胃黏膜组织均高于对照组,更多的机制探讨需要进一步实验验证。

4 结论

幽门螺杆菌感染后,存在多个信号通路的激活,包括炎症,免疫反应,细胞凋亡信号,而后出现组织细胞修复、增殖活化等。而这些在组织细胞间异常表达的基因,提示我们是否可能通过相关信号通路药物,从而避免幽门螺杆菌感染所造成的严重后果,同时也给我们提供了进一步研究的方向。

参考文献
[1]
MOCANU V, DANG J T, SWITZER N, et al. The effect of helicobacter pylori on postoperative outcomes in patients undergoing bariatric surgery:a systematic review and meta-analysis[J]. Obesity Surgery, 2017, 28(5): 1-7. DOI:10.1007/s11695-017-3024-8 (0)
[2]
KOUNTOURAS J, POLYZOS S A, DOULBERIS M, et al. Potential impact of helicobacter pylori-related metabolic syndrome on upper and lower gastrointestinal tract oncogenesis[J]. Metabolism Clinical & Experimental, 2018, 87(10): 18-24. DOI:10.1016/j.metabol.2018.06.008 (0)
[3]
ZAGARI R M, RABITTI S, EUSEBI L H, et al. Treatment of helicobacter pylori infection:a clinical practice update[J]. European Journal of Clinical Investigation, 2017, 48(1): e12857. DOI:10.1111/eci.12857 (0)
[4]
BARRETT T, WILHITE S E, LEDOUX P, et al. NCBI GEO:archive for functional genomics data sets-update[J]. Nucleic Acids Research, 2013, 39(Database issue): 1005-1010. DOI:10.1093/nar/gks1193 (0)
[5]
KAPUR K, XING Y, OUYANG Z, et al. Exon arrays provide accurate assessments of gene expression[J]. Genome Biology, 2007, 8(5): R82. DOI:10.1186/gb-2007-8-5-r82 (0)
[6]
GRACE C, NACHEVA E P. Significance analysis of microarrays (sam) offers clues to differences between the genomes of adult philadelphia positive all and the lymphoid blast transformation of cml[J]. Cancer Informatics, 2012, 11(11): 173-183. DOI:10.4137/CIN.S9258 (0)
[7]
LARSSON O, WAHLESTEDT C, TIMMONS J A. Considerations when using the significance analysis of microarrays (SAM) algorithm[J]. BMC Bioinformatics, 2005, 6(1): 129. DOI:10.1186/1471-2105-6-129 (0)
[8]
The Gene Ontology consortium. Expansion of the Gene Ontology knowledgebase and resources[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(D1): D331-D338. DOI:10.1093/nar/gkw1108 (0)
[9]
DU J, LI M, YUAN Z, et al. A decision analysis model for KEGG pathway analysis[J]. BMC Bioinformatics, 2016, 17(1): 407. DOI:10.1186/s12859-016-1285-1 (0)
[10]
SALAMA N R, HARTUNG M L, MULLER A. Life in the human stomach:persistence strategies of the bacterial pathogen Helicobacter pylori[J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(6): 385-399. DOI:10.1038/nrmicro3016 (0)
[11]
NEJATI S, KARKHAH A, DARVISH H, et al. Influence of helicobacter pylori virulence factors CagA and VacA on pathogenesis of gastrointestinal disorders[J]. Microbial Pathogenesis, 2018, 117: 43-48. DOI:10.1016/j.micpath.2018.02.016 (0)
[12]
PARK J Y, FORMAN D, WASKITO L A, et al. Epidemiology of helicobacter pylori and CagA-Positive infections and global variations in gastric cancer[J]. Toxins (basel), 2018, 10(4): 163. DOI:10.3390/toxins10040163 (0)
[13]
FERRARA M, CAPOZZI L, RUSSO R. Influence of helicobacter pylori infection associated with iron deficiency anaemia on growth in pre-adolescent children[J]. Hematology, 2009, 14(3): 173-176. DOI:10.1179/102453309X402287 (0)
[14]
HUGHES W S. An hypothesis:the dramatic decline in heart attacks in the United States is temporally related to the decline in duodenal ulcer disease and Helicobacter pylori infection[J]. Helicobacter, 2014, 19(3): 239-241. DOI:10.1111/hel.12123 (0)
[15]
OSMAN S M, MUBARAK S M, OMER I M, et al. Helicobacter pylori infection and the onset of type 1 diabetes mellitus in Sudanese children[J]. Sudanese Journal of Paediatrics, 2016, 16(2): 59. (0)
[16]
LI J Z, LI J Y, WU T F, et al. Helicobacter pylori infection is associated with type 2 diabetes, not type 1 diabetes:an updated meta-analysis[J]. Gastroenterology Research and Practice, 2017, 2017(5): 5715403. DOI:10.1155/2017/5715403 (0)
[17]
ZHAO C, LU X, BU X, et al. Involvement of tumor necrosis factor-alpha in the upregulation of CXCR4 expression in gastric cancer induced by Helicobacter pylori[J]. BMC Cancer, 2010, 10(1): 419. DOI:10.1186/1471-2407-10-419 (0)
[18]
YU S, WU T, CHENG C, et al. Combined evaluation of expression of cxcr4 and nrf2 as prognostic factor for patients with gastric carcinoma[J]. Anticancer Agents In Medicinal Chemistry, 2018, 18(3): 388-393. DOI:10.2174/1871520617666171103112019 (0)
[19]
STOLLBERG S, KÄMMERER D, NEUBAUER E, et al. Erratum to:differential somatostatin and CXCR4 chemokine receptor expression in MALT-type lymphoma of gastric and extragastric origin[J]. Journal of Cancer Research & Clinical Oncology, 2016, 142(11): 2239-2247. DOI:10.1007/s00432-016-2312-3 (0)
[20]
FAKHARI S, KALANTAR E, NIKZABAN M, et al. Effect of helicobacter pylori infection on stromal-derived factor-1/CXCR4 axis in bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Advanced Biomedical Research, 2014(3): 19. DOI:10.4103/2277-9175.124650 (0)
[21]
CHEN J P, WU M S, KUO S H, et al. IL-22 negatively regulates Helicobacter pylori-induced CCL20 expression in gastric epithelial cells[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e97350. DOI:10.1371/journal.pone.0097350 (0)
[22]
NAKASHIMA Y, ISOMOTO H, MATSUSHIMA K, et al. Enhanced expression of CXCL13 in human Helicobacter pylori-associated gastritis[J]. Digestive Diseases & Sciences, 2011, 56(10): 2887-2894. DOI:10.1007/s10620-011-1717-8 (0)
[23]
RAJA U M, GOPAL G, SHIRLEY S, et al. Immunohistochemical expression and localization of cytokines/chemokines/growth factors in gastric cancer[J]. Cytokine, 2017, 89: 82-90. DOI:10.1016/j.cyto.2016.08.032 (0)
[24]
WU D, CAO M, PENG J, et al. The effect of trimethylamine N-oxide on Helicobacter pylori-induced changes of immunoinflammatory genes expression in gastric epithelial cells[J]. International Immunopharmacology, 2017, 43: 172-178. DOI:10.1016/j.intimp.2016.11.032 (0)
[25]
ZHAO J, DONG Y, KANG W, et al. Helicobacter pylori-induced STAT3 activation and signalling network in gastric cancer[J]. Oncoscience, 2014, 1(6): 468-475. (0)
[26]
WEST A C, TANG K, TYE H, et al. Identification of a TLR2-regulated gene signature associated with tumor cell growth in gastric cancer[J]. Oncogene, 2017, 36(36): 5134-5144. DOI:10.1038/onc.2017.121 (0)
[27]
ZHANG L, LIU Y, WANG X, et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 9447. DOI:10.1038/srep09447 (0)
[28]
XU Y, MA H, YU H, et al. The miR-184 binding-site rs8126 T>C polymorphism in TNFAIP2 is associated with risk of gastric cancer[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e64973. DOI:10.1371/journal.pone.0064973 (0)