2019, Vol. 17
目前幽门螺杆菌感染(Helicobacter pylori，HP)已经非常常见，平均大约50%的人群有感染[1]，特别是在贫困地区，因为自然环境、饮食卫生条件、及民俗习惯等感染率会更高。HP感染者可能会导致慢性活动性胃炎，糜烂性胃炎，以及消化道溃疡等消化道疾病，甚至造成食管腺癌，胃萎缩，胃癌和结直肠癌的潜在治病因素[2]。目前对于HP感染已经有多种根治治疗方案，但由于耐药菌的增多，部分患者效果较差[3]。同时一部分感染者并不是都会出现炎性改变或者癌变，为了认识HP感染对于胃粘膜组织损伤的分子机制，设计了对于HP相关芯片的生物信息学分析。
1 材料和方法 1.1 芯片数据来源从GEO网站下载相关的基因芯片数据(GSE5081)[4]。该芯片使用微阵列比较了HP阳性和HP阴性胃糜烂和正常相邻粘膜的全基因组基因表达谱，对HP感染后mRNA表达模式进行分析。从8例HP阴性糜烂性胃窦炎患者和8例HP阳性糜烂性胃窦炎患者的冷冻活检标本中提取总RNA。同时，从所有16名患者的邻近(距离侵蚀至少3 cm)肉眼可见的正常窦腔样品取样。其中本研究涉及HP阴性患者包括三名男性患者和五名女性患者，年龄为50~88岁(中位数67.5岁)。组织学炎症程度轻度6例，中度2例。其中两人患有肠化生。本研究涉HP阳性感染者年龄为32~75岁(中位数58.5岁)，5名男性和3名女性患者。组织学炎症程度轻度3例，中度1例，严重4例。其中两人有中度萎缩，一人有局灶性肠化生。在内镜检查时，没有患者接受质子泵抑制剂或抗生素治疗。所有患者属于高加索人种族。他们都没有吸烟，还有其他已知的疾病。
1.2 芯片数据生物信息分析首先芯片的质量评估[5]，通过分组差异基因的筛选[6]，并功能分析、注释。把组织样本分为4组，A) ER(+)HP(+), B) ER(+)HP(-), C) ER(-)HP(+), D) ER(-)HP(-), 其中HP为幽门螺杆菌，而ER为损伤粘膜组织。分别分析受损组织，健康组织组内的HP感染与否的差异基因变化，最后合并分析。具体是A、B组进行了差异分析得到分析结果差异分析1。C、D组进行了差异分析得到分析结果差异分析2(Q值< 0.05，Fold change≥1.2，阈值设定为分析软件推荐值)。将两组获得的差异基因取并集，随后进行GO分析、通路分析，以及基因共表达网络分析，基因相互作用网络分析。
1.3 实时定量PCR验证收集2016年1月至2016年6月，在解放军联勤保障部队第925医院C14尿素氮呼气试验阳性者(CPM>100)为感染者，检测阴性者为健康对照各10例，考虑诊断为慢性糜烂性胃炎，并且在内镜检查时，没有接受质子泵抑制剂或抗生素治疗，排除其他疾病。感染者与对照组一般临床特征无统计学差异，均取受损黏膜组织，在获取胃黏膜组织后，使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取总RNA，然后进行反转录。cDNA被适当稀释并用于PCR。使用SYBR Premix EX Taq(TAKARA)和ABI PRISM 7300实时PCR系统(Applied Biosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)以β-actin作为参考对照，一式三份进行实时PCR。引物由上海生工公司合成，CXCR4引物上游：5'-CCTATGCAAGGCAGTCCATGT-3'，下游：5'CCTATGCAAGGCAGTCCATGT 3'，内参基因β-actin引物：上游：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA -3'，下游：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。CXCL2上游引物:CGCAGCAGGAGCGCC下游引物: TGGATGTTCTTGAGGTGAATTCC CXCL5上游引物:GGAAGGAAATTTGTCTTGATCC下游引物: TTTCCTTGTTTCCACCGTC。参与本研究的所有HP感染患者和正常人均已签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准。
1.4 统计方法差异基因筛选主要利用文献的常用方法(Significance Analysis of Microarray，SAM)。两组间计量资料采用使用T检验(平均数±SD)，计数采用卡方检验，p < 0.05，有统计学差异。统计及分析软件使用spss23，以及GCBI在线实验室分析软件。
2 结果分析 2.1 芯片质量分析总样本数量共31个。对获得的样本，首先进行质量分析，每张芯片的RLE(Relative Log Expression)计算了芯片信号值估计在整体芯片中的相对变化率，进而反映了所检测基因的变化特征。本芯片RLE一致性较高，芯片本身质量无问题(见图 1)。质量较高的芯片，才有必要进行下一步的研究分析，否则需要舍去不合格的样本。
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图 1 基因芯片质量分析箱形图 Figure 1 Quality analysis box chart |
应用SAM法[7]分析在预先设定的分组下筛选具有显著性差异的基因。通过分析A，B组，得到在受损的胃粘膜组织，HP(+)vs HP(-)的差异基因1，共28个(见图 2)。
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图 2 A、B组差异分析1聚类分析和火山图 Figure 2 Cluster analysis chart of Group A and B, volcano map in DEG1 注：(a)中红色代表上调基因，绿色代表下调基因(颜色详见电子版http://swxxx.alljournals.cn/ch/login.aspx.(2019年第1期))；(b)中横坐标代表差异倍数，纵坐标代表P值均取log |
通过分析C，D组，我们得到在健康的胃粘膜组织，HP(+)vs HP(-)的差异基因(见图 3)，共27个。同时两个差异基因集取并集获得上调差异基因44个。提示在HP感染后，这些基因的高表达与疾病的发生发展有关。
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图 3 C、D组差异分析2聚类分析和火山图 Figure 3 Cluster analysis chart of Group C and D volcano map in DEG2 |
基因功能注释的目的是发现这些差异基因在生物学功能，代谢途径中的地位和意义，研究基因表达调控网络，及其功能机制。Go分析[8]发现这些差异基因主要涉及免疫反应，炎症反应，抗原提呈，细胞间信号通路等，而KEGG信号通路分析[9]，主要包括：细胞因子信号通路，因子受体相互作用，细胞粘附等通路。
2.4 核心节点基因网络分析基因相互作用(Gene signal network)分析解构了KEGG数据库，突破限制获得单一信号通路中基因之间的相互作用。因此，可以获得一些基因的上下游分子关系。通过分析发现差异基因的相互作用：CXCR4, CCL20, CXCL13, CXCL3, CXCL5, CXCL2, HLA-DMA, HLA-DQA1, HLA-DPA1, HLA-DOA, HLA-DQB1存在有网络作用，其中核心分子为CXCR4(见图 4)。
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图 4 基因相互作用网络图 Figure 4 Gene interaction network diagram |
共表达网络清楚的揭示了两基因之间的关系，并找到调控网络的关键基因。这是通过基因间相关系数来拟合基因无标度网络关系实现的。分析基因共表达得到CCL20，PLEK，HLA-DMA，JAK3，BCL2A1，TNFAIP2，CXCL13，PTPRC，CXCL3，FGR，FAM65B，C3，CXCL5，MMP9，VNN2，ADAMDEC1，GZMK, TLR10之间共表达关系，其中重要的节点分子为CCL20，JAK3，TNFAIP2，PLEK，HLA-DMA，PTPRC，CXCL13，BCL2A1(见图 5)。
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图 5 基因共表达分析网络图 Figure 5 Gene co-expression network diagram |
通过实施定量PCR方法，验证在感染后的胃黏膜组织部分相关基因的表达情况。研究发现CXCR4, CXCL5, CXCL2在HP阳性的胃黏膜组织表达高于HP阴性对照组，且具有统计学意义(P < 0.05)(见图 6)。
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图 6 实时定量PCR检测CXCR4, CXCL5, CXCL2在胃黏膜组织中的表达(*提示P < 0.05) Figure 6 Real-time quantitative PCR detection of CXCR4, CXCL5, and CXCL2 expression in gastric mucosa |
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表 1 主要涉及GO基因分类(前10) Table 1 Top 10 GO mainly involved gene classification |
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表 2 主要涉及的信号通路(前10) Table 2 Top 10 mainly involved signaling pathway |
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性细菌，最初是由Warren和Marshall于1983在胃上皮的管腔表面发现，并分离出来，从第一次发现幽门螺杆菌，研究其与临床消化道疾病关系以来，已经经历三十多年[10]。绝大多数HP感染患者不会有任何临床意义上的表现，仅仅在部分患者当作引起消化道疾病治病因素，其中毒力因子空泡毒素(VacA)[11]，细胞毒素相关基因A (CagA)[12]被认为是重要的治病因素。为了认识该细菌，以及了解其致病机制，做了许多研究，包括体内以及体外研究。
目前发现幽门螺杆菌与消化道疾病关系紧密，但同时与心血管疾病，贫血，脑梗，糖尿病等疾病均有关联[13-16]。为了进一步认识幽门螺杆菌对胃粘膜组织的分子层面影响，分析幽门螺杆菌相关芯片。Go分析：主要涉及免疫反应，炎症反应，抗原提呈，细胞信号通路等。Pathways通路分析：提示主要涉及的信号通路包括：细胞因子通路，因子受体关联，细胞粘附分子等。
基因相互作用分析中发现重要的CXCR4基因，与趋化因子的互相作用，在人类发育、免疫应答、癌转移均起到了重要的作用。已经有临床研究证明CXCR4在HP患者当中高表达[17]，部分的HP感染患者可能会引起消化道肿瘤，CXCR4与消化道肿瘤的高表达有关系[18]，这是否和CXCR4的过度激活有关？同时在已有研究中发现胃淋巴瘤观察到CXCR4和Ki-67表达之间的相关性，并提示CXCR4可作为诊断和治疗MALT型胃淋巴瘤潜在靶点[19]。不仅如此，近年来研究表明在慢性幽门螺杆菌感染过程中，骨髓间充质干细胞迁移到胃组织，也可能是胃腺癌的起源[20]。
基因共表达分析中重要的节点分子为趋化因子CCL20[21]，CXCL13[22]，CXCL5[23]，CXCL2[24]以及其他包括增殖，炎症，免疫，凋亡相关重要分子JAK3, TNFAIP2, PLEK, HLA-DMA, PTPRC, BCL2A1的激活，而这些基因与胃癌的发生发展有密切关系[25-28]。有研究证实幽门螺杆菌诱导的STAT3激活直接上调JAK3，可能有助于胃癌的发生和发展[25]。为了进一步验证分析相关分子的表达情况，进行了实时定量PCR实验验证，CXCR4，CXCL5，CXCL2在幽门螺杆菌感染后的胃黏膜组织均高于对照组，更多的机制探讨需要进一步实验验证。
4 结论幽门螺杆菌感染后，存在多个信号通路的激活，包括炎症，免疫反应，细胞凋亡信号，而后出现组织细胞修复、增殖活化等。而这些在组织细胞间异常表达的基因，提示我们是否可能通过相关信号通路药物，从而避免幽门螺杆菌感染所造成的严重后果，同时也给我们提供了进一步研究的方向。
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