人类基因中大约有180 000个外显子，占人类基因组的1%，约30 Mb^[1]。全外显子组测序(Whole Exome Sequencing，WES)是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA富集后再进行高通量测序的基因组分析方法^[2]。目前外显子组测序主要用于识别和研究疾病、种群进化相关的编码区及调控区域内的结构变异，结合大量公共数据库提供的全外显子组数据，有利于更好地解释变异之间的关联和疾病的致病机理，因此全外显子组组测序具有广阔的应用前景^[3-5]。

全外显子组测序技术的应用同时促进了分子诊断水平的发展。分子诊断主要指与疾病相关的各种结构蛋白、酶、抗原抗体、免疫活性分子基因的检测。大多数的研究主要集中在疾病相关的基因检测，但ABO血型的分子诊断也尤为重要^[6-7]。ABO血型判定在临床上有着重大意义，主要用于临床输血、器官移植选择血型相符的供体、不孕症和新生儿溶血症病因分析、亲子鉴定等方面。目前相对较完善和标准化的技术是血清学判定方法，但只能判定ABO血型的表现型，而在某些疑难样本、产前胎儿血型判定和遗传学研究等方面该技术受到限制。随着血型系统中多种亚型和基因多态性的深入研究，血型分子诊断技术克服了血清学技术中的一些限制，能够更加准确判定血型亚型^[8-9]。

目前血型分子诊断技术主要基于PCR方法比如聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)和基因芯片技术。PCR-SSP方法基于已知序列分别设计特异性引物，直接扩增出目的基因片段，通过凝胶电泳分析基因型结果。该方法简单快捷、易于操作，但也有不足之处如扩增引物设计缺陷、技术人员操作水平、电泳图谱的质量低、低丰度变异检测率低等问题都会影响最终结果的判定^[10-13]。基因芯片技术是指经过标记的待测样本通过与芯片上特定位置的探针杂交，可根据碱基互补配对原则确定靶序列，经激光共聚焦显微镜扫描后以计算机对荧光信号进行比较和检测迅速获取信息。该技术可大量检测和分析DNA变异及多态性，自动化程度高，快速分析差异表达基因等，但其缺点是重复多次使用后芯片或微阵列的敏感性会降低，样品的制备和标记较复杂等^[14-15]。两种分子检测技术的共有的局限性是只能检测出已知的基因序列信息，不能发现新的基因变异。而二代测序中的全外显子组测序技术，相比前两种技术避免了这一不足。该方法是一种序列比对方法，通过检测样本序列与已知序列进行比对，从而找出所有变异位点信息，并对变异信息进行生物信息大数据统计和分析，最终得到可信度和准确度高的变异信息。全外显子组测序方法位点覆盖度高，除已知位点变异外还可以发现新的变异位点信息，能够更加精确检测ABO的基因型。目前国内外还没有关于应用全外显子组测序技术检测ABO血型的相关报道。因此，基于以上研究与分析，全外显子组测序用于ABO血型的基因型判定更加精确，其遗传规律也更加清晰，是临床血型判定方法较好的辅助手段。

1 全外显子组测序中ABO血型判定方法

基于全外显子组测序的基因检测结果，利用Excel VBA程序对ABO进行基因分型。该方法的核心思想为将基因突变转换为数字：在单条染色体下，0定义为野生型，1为杂合突变; 在两条染色体下，0定义为野生型，1为杂合突变，2为纯合突变。将两条染色体的纯杂合变异转换为两条染色体的数字相加，预先生成所有的二倍体化的ABO基因型的组合情况，最后测序结果数据与这个二倍体化的表格进行比对来判别(ABO血型判定的核心方法见图 1)。该方法方便快捷，节约了时间和人力成本，有利于分析查看样本每个位点信息，有助于积累中国人群血型亚型数据，具有潜在的生物信息分析价值。

2 全外显子组测序中ABO血型判定基本流程

本文ABO血型判定基本流程主要分为三个部分：ABO基因型判定数字化过程、获取染色体绝对位置和WES数据处理。其中ABO基因型判定数字化过程主要通过4个VBA程序最终获得《ABO数字化表—二倍体化》工作表; 获取染色体绝对位置部分通过1个VBA程序和人工修正获得《染色体绝对位置表—数字化》和《染色体绝对位置表—数字化修正》工作表; WES数据处理部分通过生物信息数据分析后获得《ABO基因测序结果列表》，然后在程序6.1的运行下获得《ABO基因测序结果列表—数字化》工作表; 最后运行程序6.2，将《ABO数字化表—二倍体化》和《ABO基因测序结果列表—数字化》两个工作表进行关联，经过程序自动检索对比，最终输出ABO基因型结果，基本判定流程见图 2。

3 全外显子组测序ABO血型判定具体过程 3.1 ABO等位基因汇总表的下载、复核和工作簿建立

(1) 从NCBI-dbRBC在线数据库下载ABO等位基因汇总表，进行精细划分和处理：去除内含子区域的变异位点(但保留内含子与外显子相接的50 bp范围，因某些内含子位点会影响ABO的基因型结果)，获得《ABO-SNP位点变异列表》。

(2) 根据dbRBC的在线版记录结果进行查漏补缺，复核每一个位点的碱基突变情况。

以A101型为参考型，最终共计A/B/O/AB型的316种亚型，其中A型共有134种亚型，包含A1、A2、A3、Am、Ax、Aw、Ael等; B型共有91种亚型，包含B1、B3、Bel、Bm、Bw、Bx等; AB杂合亚型共有17种，包含cis-AB、B(A)等; O型共有74种亚型，包含O1、O80等。从碱基位置1至1 116位，合计180个SNP位点。该部分结果整理到《ABO血型的基因判定》工作簿的《ABO突变总表》工作表中。

(3) 创建《ABO血型的基因判定》工作簿(WorkBook)，该工作簿建立以下7个工作表(WorkSheet)：1)《ABO突变总表》; 2)《ABO碱基数字对应表》; 3)《ABO数字化表—网格状》; 4)《ABO数字化表—去重后》; 5)《ABO数字化表—二倍体化》; 6)《染色体绝对位置表—数字化》; 7)《染色体绝对位置表—数字化修正表》。以下7个程序运行完毕后，除《临时》工作表，其它工作表都将填写完毕内容。具体程序详见附件。

3.2 碱基变异与数字对应

ABO区分型共计180个基因位点，每个位点最多出现3种变异型，野生型和变异型分别以数字0，1，3，7表示，其中1代表出现次数最多的变异型，其次是3，再次是7，将每个位点出现的突变的种类统计并以竖排的方式列出来，运行程序1后结果输出在《ABO碱基数字对应表》工作表中。

3.3 数字化总表

以《ABO突变总表》为结构蓝本，将所有的碱基转换为数字，空白代表与A101一致，用0表示，其它变异型按《ABO碱基数字对应表》转换为数字。最终将《ABO突变总表》中的316种亚型和180个位点进行数字化标注，得到一张网格状的数字化总表，运行程序2后结果输出在《ABO数字化表—网格状》工作表中。

3.4 去重复

《ABO数字化》工作表中包含的316种亚型，其数字化结果会出现所有突变完全相同的结果(也就是突变完全相同的两种亚型)，因此需要进行去重复，运行程序3去除完全相同的亚型，最终得到去重后的ABO数字化表，保留285种亚型，结果输出在《ABO数字化表—去重后》工作表中。

3.5 二倍体化

由于等位基因位于成对的染色体上，因此ABO血型的基因型由一对等位基因决定。将去重ABO数字化总表进行二倍体化，也就是两两组合、对应位置数字相加，得到285种亚型全部的二倍体数字化结果，最终得到40 755种组合，从A101/A101、A101/A102、A101/A103…到O80/O80。运行程序4后结果输出在《ABO数字化表—二倍体化》工作表中。

3.6 染色体绝对位置

(1) 参考NCBI数据库，ABO基因共有7个外显子区域，每个外显子查询一个已知的位点，获取GRCh37版本的染色体绝对位置，运行程序5，获得每个染色体绝对位置各个碱基测序结果的数字化后的数值，结果记录在《染色体绝对位置表—数字化》工作表的前4列中，前4列的表头分别为：外显子编号、该外显子最小碱基、碱基位置、染色体绝对位置(GRCh37);

(2) 上表数字化后需要根据下机数据的格式和输出方式进行人工调整，最终结果保存在《染色体绝对位置表—数字化修正》工作表中。

3.7 ABO精细血型判定

WES测序的下机数据，将ABO基因的测序结果单独输出到一个表格《ABO基因测序结果列表》，结果表格的前3列分别为：碱基位置、染色体绝对位置、测序结果。运行程序6.1，将测序结果按《染色体绝对位置表—数字化修正》工作表的数字化规则转换为数字。运行程序6.2，将《ABO基因测序结果列表》与预先生成好的《ABO数字化表—数字化》工作表进行检索比对，数字差异个数为0的即为该样本的ABO血型基因判定结果，结果输出在D2单元格内。

4 VBA程序运行实例

随机选取30个样本的全外显子组测序结果进行测试，其ABO基因分型的结果与事先在医院检测的血清学表型一致，这30个样本包含A、B、AB和O型血。本文列举了8个样本的血型判定结果如表 1。

5 讨论

1) 随着高通量测序技术的普及和发展，本文ABO血型的判定方法充分利用了全外显子组测序技术的优势。该技术与现有血型分子诊断方法PCR法和基因芯片法相比，简便快捷且能更加精确判定血型亚型，尤其对于临床上疑难样本的鉴定、产前胎儿血型判定和血型遗传学研究等方面有重大作用，是临床上血型精确判定的有效辅助手段。

2) 由于全外显子组测序的生物信息数据分析较为复杂，针对ABO血型判定需要开发新的算法，因此本文运用VBA程序的方法节约了时间和人力成本，方便快速且自动化程度高，同时也解决了ABO亚型分型信息实时更新的问题，保证数据信息的全面可靠性。VBA程序方法的核心思想为将基因突变转换为数字：0定义为野生型，1为杂合突变，2为纯合突变; 单条染色体的二倍体化转换为两条染色体的数字相加; 测序结果与已知血型序列之间的同源比对，转换成简单的数字比较。但本方法也存在缺点：无法区分两个相距较远的杂合突变是在一条染色体上还是在分别在两条染色体上，即不能判定各个杂合突变的连锁情况。但是全外显子组测序的读长很短，一般不超过150bp，各外显子之间很大的内含子区域无测序数据，全外显子组测序本身就比较难以获得一个基因突变的连锁情况，因此本文采用的数字化方法，并没有丢失太多有效的测序信息。该方法通过多个位点的突变来判别一个二倍体的基因型组合，除了ABO血型判定外，还可以应用在其它方面的基因型判定，例如药物代谢酶的基因亚型判定等。

3) 利用该方法判定ABO血型，经过血型表型的核实，证明该方法的初步判定结果是一致的，进一步表明该方法的准确度很高。目前临床中仍以血清学作为血型判定的主要方法，而该方法的判定结果可以作为临床应用的辅助手段，具有很大的应用潜力。