2018, Vol. 16
蛋白激酶(Protein Kinase，PK)是生物体内重要的调控蛋白，对很多重要的生理功能(如生长、代谢、衰老等)起关键调控作用。Sch9是芽殖酵母中重要的蛋白激酶，现已被证实Sch9参与调控多种信号途径和细胞过程，如细胞凋亡[1]、细胞自噬[2]、染色体重组与基因组稳定性[3]及寿命调控[4-5]等，近年来Sch9在寿命调控中的作用正被广泛研究。蛋白激酶S6K1是哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白(mTOR)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的底物，且与很多人类疾病相关，包括肥胖症、糖尿病和癌症[6]。研究显示，S6K1也参与寿命调控，且发现Sch9与S6K1为同源蛋白[7]。
在芽殖酵母中Pkh1/2调节下游的AGC蛋白激酶家族(包括Ypk1、Pkc1、Sch9)[8]。Pkh1/2可以磷酸化Sch9中活性环位点的苏氨酸(PDK1位点)来激活Sch9[9]。另外研究表明Sch9蛋白激酶C末端737位苏氨酸为另一个保守的磷酸化位点(PDK2位点[10-11]。最近系列研究表明Sch9与酵母的寿命调控密切相关[12-13]，主要机制是Sch9是寿命调控重要因子TORC1(Target of Rapamycin Complex 1)的下游靶标，TORC1可通过磷酸化Sch9 C末端6个残基而调控包括寿命调控在内的多种细胞功能[5, 7]。同时发现Sch9参与细胞热胁迫应答[14]。在雷帕霉素(Rapamycin，一种TORC1的特异抑制剂)的作用下Sch9可发生明显去磷酸化，调节核蛋白的产生[7]。
mTOR是哺乳动物中重要的寿命调控蛋白，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究表明在mTOR复合物1(mTORC1)中mTOR与调节蛋白“Raptor”结合，而在mTOR复合物2(mTORC2)中，mTOR与雷帕霉素不敏感组分“Rictor”结合，雷帕霉素主要作用于mTORC1而非mTORC2 [15]。mTORC1激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB / Akt)，从而磷酸化下游靶标核糖体蛋白S6激酶1(S6K1，Sch9的同源蛋白)和真核起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)而促进蛋白质合成[16]。研究显示mTORC1特异磷酸化S6K1 Thr389，从而激活S6K1，进而磷酸化核糖体蛋白S6而促进蛋白合成[17-18]。
鉴于Sch9及S6K1蛋白在生物体内的重要的调控功能，且目前尚缺乏系统的对Sch9及S6K1进行性质、结构及功能的分析研究，本文利用生物信息学手段较全面分析了Sch9与S6K1蛋白的理化性质、结构特点及其相互作用蛋白，为进一步深入研究Sch9与S6K1蛋白分子功能与作用机制提供了思路。
1 材料与方法 1.1 材料Sch9及S6K1蛋白的序列信息来自于NCBI数据库，本文选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Sch9(检索号：CAA40853)与人的S6K1(检索号：P23443.2)进行研究。
1.2 方法 1.2.1 Sch9与S6K1理化性质分析使用ExPASy数据分析系统中的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具，对Sch9的分子量、分子式、酸碱性和稳定性等理化性质进行分析。使用Protscale工具(http://web.expasy.org/protscale/)对Sch9与S6K1的亲疏水性进行分析。使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析Sch9与S6K1有无切割位点和信号肽，TMHMM 2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-M/)分析Sch9与S6K1的跨膜区域。
1.2.2 Sch9与S6K1亚细胞定位预测使用PSORTII(https://psort.hgc.jp/)进行Sch9与S6K1的亚细胞定位预测。
1.2.3 Sch9与S6K1二级结构和高级结构分析使用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr-/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测Sch9与S6K1的二级结构及各成分所占比例。使用NCBI的Conserved Domain数据库分析Sch9与S6K1的结构域。
1.2.4 相互作用蛋白分析使用STRING数据库(http://string-db.org/)，设置高置信度为0.7，构建Sch9与S6K1相互作用的蛋白网络。
1.2.5 Sch9与S6K1系统进化树构建通过BLASTp搜索得到Sch9在不同种属酵母中的同源蛋白、S6K1在不同物种中的同源蛋白质序列。使用Clustal2.1软件进行Sch9与S6K1同源蛋白间的多重序列比对。使用MEGA6软件，Neighbor-joining方法，设置Boot-strap分析重复数为1 000，构建分子进化树。
2 结果与分析 2.1 基因的编码产物分析S6K1蛋白有a、b、c、d、e五种亚型，其对应的转录产物有：NM_003161.3、NM_001272042.1、NM_001272043.1、NM_001272044.1、NM_001272060.1，Sch9与S6K1基因具体基因编码产物分析如表 1。
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表 1 Sch9与S6K1基因编码产物分析 Table 1 Gene encoding product analysis of Sch9 and S6K1 |
通过ExPA数据库中的ProtParam在线工具预测，可得到Sch9与S6K1蛋白相应理化性质，如表 2。
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表 2 Sch9与S6K1蛋白理化性质 Table 2 Chemical properties of Sch9 and S6K1 protein |
由表 2可以看出，Sch9蛋白与S6K1蛋白均为酸性蛋白质，Sch9蛋白与S6K1蛋白不同主要表现在：Sch9蛋白为稳定蛋白质，S6K1为不稳定蛋白质，二者含量最高的氨基酸不相同。
利用ExPASy数据库中的ProtScale在线工具预测，确定Sch9与S6K1亲疏水性(见表 3及图 1)。由图 1可知，Sch9与S6K1亲水区域多于疏水区域，均属于亲水蛋白质蛋白。
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表 3 Sch9与S6K1蛋白亲疏水性分析 Table 3 Hydrophobicity analysis of Sch9 and S6K1 protein |
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图 1 Sch9与S6K1蛋白的亲疏水性分析 Figure 1 Hydrophilic-hydrophobic analysis of Sch9 and S6K1 protein |
利用PSORTII分析Sch9与S6K1蛋白的亚细胞定位，结果见表 4，可看出Sch9与S6K1蛋白均最有可能定位在细胞核。
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表 4 Sch9与S6K1蛋白的亚细胞定位分析 Table 4 Subcellular localization of Sch9 and S6K1 protein |
SignalP 4.0预测Sch9蛋白与S6K1蛋白均无信号肽序列(见图 2)。不足以形成经典的信号肽区域。信号肽预测结果见表 5。
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图 2 Sch9与S6K1蛋白信号肽分析 Figure 2 Signal peptides analysis of Sch9 and S6K1 protein |
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表 5 Sch9与S6K1蛋白信号肽预测分析 Table 5 Signal peptide analysis of Sch9 and S6K1 protein |
经TMHMM 2.0预测Sch9与S6K1蛋白均无跨膜结构域(见图 3)。二者位于膜外(粉色细线)的概率几乎为100 %，位于膜内(蓝色细线)和跨膜区域(红色细线)的概率几乎为0。粉色粗线代表多肽链中跨膜区域所在位置，因二者没有跨膜区域，所以在粗线上不显示相应标记。
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图 3 Sch9与S6K1蛋白跨膜结构分析 Figure 3 Trans-membrane domain analysis of Sch9 and S6K1 protein |
利用SOPMA分析Sch9与S6K1蛋白的二级结构(见图 4)，与相应二级结构占比(见表 6)由此可见，Sch9与S6K1蛋白的二级结构非常相似，各种构象所占百分率很接近。
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图 4 Sch9和S6K1的二级结构分析 Figure 4 Secondary structure analysis of Sch9 and S6K1 protein |
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表 6 Sch9与S6K1蛋白的二级结构分析 Table 6 Secondary structure analysis of Sch9 and S6K1 protein |
通过NCBI的Conserved Domain数据库预测Sch9蛋白属于C2超家族和PKc_like超家族(见图 5)。PKc_like超家族中的STKc结构域能够催化磷酸基团从ATP转移到蛋白底物的丝氨酸/苏氨酸残基上，从而使蛋白底物磷酸化。海藻糖作为碳水化合物储备和应激代谢物，在酵母对环境变化的响应中起着重要的作用，Sck1在由葡萄糖和氮源触发的海藻糖酶活化中起作用。二糖海藻糖在海藻糖酶催化作用下裂解为葡萄糖。C2结构域首先在PKC中被鉴定。许多C2结构域是Ca2 +依赖性膜靶向模块，其结合多种物质，包括结合磷脂，肌醇多磷酸酯和细胞内蛋白质等。大多数C2结构域蛋白是含有单个C2结构域的信号转导酶，例如蛋白激酶C，或含有至少两个C2结构域的膜运输蛋白，如突触结合蛋白1。然而，具有钙结合区的C2结构域具有带负电荷的残基，主要是天冬氨酸，其充当钙离子的配体。Ypk1是细胞生长所必需的，在酵母的鞘脂介导的信号传导途径中起着下游激酶的作用，在高效的胞吞作用和维持细胞壁完整性方面也发挥作用。
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图 5 Sch9和S6K1的功能结构域分析 Figure 5 Functional domains analysis of Sch9 and S6K1 protein |
S6K1蛋白也属于PKc_like超家族(见图 5)，其位点为丝氨酸/苏氨酸激酶的催化结构域，其属于70kDa核糖体蛋白S6激酶。STKs催化γ-磷酰基从ATP转移到蛋白质底物上的丝氨酸/苏氨酸残基。它作为STK mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶标)的下游效应物，在蛋白质合成期间在翻译机制的调节中起作用。其靶标有S6，翻译起始因子eIF3和胰岛素受体底物IRS-1等。
2.6 Sch9与S6K1蛋白质相互作用分析使用STRING数据库预测Sch9及S6K1的相互作用的蛋白质，设置为高置信度0.7，构建Sch9及S6K1蛋白相互作用网络(见图 6)。与Sch9相互作用的蛋白质主要包括Cyr1、TOR1(Target of Repamycin complex 1)、TOR2(Target of Repamycin complex 2)、Pkh1/2等，该网络涉及到的生物过程有：MAPK级联反应(GO:0000165MAPK cascade)、细胞内信号转导(GO:0035556intracellular signal transduction)、参与细胞壁组织或生物合成的MAPK级联反应(GO:0000196MAPK cascade involved in cell wall organization or biogenesis)，涉及到的分子功能有：ATP结合(GO:0005524ATP binding)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性(GO:0004674protein serine/threonine kinase activity)，涉及到的细胞组成有：TORC1复合体(GO:0031931TORC1 complex)。
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图 6 Sch9及S6K1蛋白相互作用网络 Figure 6 Protein-protein interaction network for Sch9 and S6K1 protein |
与S6K1相互作用的蛋白质主要包括PIK3CA、RHEB、Rps6、RPTOR、mTOR等。该网络涉及到的生物过程有：胰岛素受体信号传导途径(GO:0008286insulin receptor signaling pathway)、细胞对胰岛素刺激反应(GO:0032869cellular response to insulin stimulus)、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路(GO:0007169transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)，涉及到的分子功能有：RNA聚合酶Ⅲ 1型启动子DNA结合(GO:0001030RNA polymerase Ⅲ type 1 promoter DNA binding)、RNA聚合酶Ⅲ 2型启动子DNA结合(GO:0001031RNA polymerase Ⅲ type 2 promoter DNA binding)、RNA聚合酶Ⅲ 3型启动子DNA结合(GO:0001031RNA polymerase Ⅲ type 3 promoter DNA binding)，涉及到的细胞组成有：TOR复合体(GO:0038201TOR complex)、细胞质(GO:0005829cytosol)，涉及到的信号通路有：mTOR信号通路(04150mTOR signaling pathway)、胰岛素信号通路(04910Insulin signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(04151PI3K-Akt signaling pathway)、AMPK信号通路(04152AMPK signaling pathway)。
2.7 Sch9与S6K1蛋白多序列比对和进化关系分析对不同物种Sch9蛋白进行多重序列比对，并构建分子进化树(见图 7)。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sch9蛋白的氨基酸序列与Saccharomyces arboricola、Naumovozyma castellii、Vanderwaltozyma polyspora、Naumovozyma dairenensis、Kazachstania naganishii、Zygosaccharomyces rouxii、Zygosaccharomyces bailii、Zygosaccharomyces parabailii、Candida的相似性分别为91%、67%、70%、68%、66%、67%，68%、68%、68%。与物种进化程度相一致，表明Sch9蛋白在进化过程中具有保守的分子功能，可以在科属级水平上进行归类。
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图 7 Sch9蛋白的分子进化树 Figure 7 Phylogenetic tree of Sch9 protein |
对不同物种S6K1蛋白进行多重序列比对，并构建分子进化树(见图 8)。人S6K1蛋白的氨基酸序列与家犬、黑猩猩、河狸、牛、抹香鲸、绵羊、大鼠、家猪、鸡和小鼠的相似性分别为99%、99%、99%、99%、97%、99%、99%、95%、97%、94%，与物种进化程度相一致，表明S6K1蛋白在进化过程中具有非常保守的分子功能。
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图 8 S6K1蛋白的分子进化树 Figure 8 Phylogenetic tree of S6K1 protein |
本研究通过生物信息学方法，分析得到Sch9是酸性稳定的亲水蛋白，无信号肽和跨膜区域，定位于细胞核的可能性最大。Sch9的主要二级结构是无规卷曲，属于C2超家族和PKc_like超家族，具有利于蛋白间相互作用的结构信息。S6K1是酸性不稳定的亲水蛋白，无信号肽和跨膜区域，定位于细胞核的可能性最大。S6K1的主要二级结构是无规卷曲，属于PKc_like超家族，具有利于蛋白间相互作用的结构信息。可见Sch9与S6K1在理化性质与结构功能有诸多相同，且两个蛋白在进化上相当保守。
通过STRING分析，Sch9除与已被功能性实验鉴定的Tor1、Tor2、Pkh1/2相互作用外，还与Cyr1蛋白有相互作用关系。Cyr1是腺苷酸环化酶，是调控cAMP产生和cAMP依赖性蛋白激酶信号传导的关键酶，活性受Ras蛋白和Gpr1的控制。部分研究指出Sch9可调节磷酸化酶[19]，推测Sch9可通过Cyr1实现对Ras信号通路的反馈抑制。
在哺乳动物细胞中，mTOR1在上游受到PI3K/Akt信号通路调节，并作用于下游靶点S6K1与4EBP1，而4EBP1与eIF4B可相互作用并且影响翻译过程，营养因子、能量供给等因素会显著影响到此信号通路，然而具体机制尚待深入研究。
由于Sch9与S6K1理化性质、结构功能相似，Sch9蛋白已经被证实其PDK1位点磷酸化调控与热量限制延长芽殖酵母时序寿命密切相关[13]，Selman等研究发现，敲除S6K1基因延长小鼠寿命，其基因表达情况与热量限制的小鼠及其相似，证实S6K1对衰老的调控与热量限制有关[20-21]，和Sch9蛋白在芽殖酵母中相似，进一步研究可从激活其酶活的C端自主调控区的多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点入手，进一步分析热量限制如何影响S6K1的表达和功能。
通过对Sch9和S6K1理化性质、结构功能及相互作用蛋白网络的全面比较分析，为进一步深入研究Sch9与S6K1的功能及调控提供理论参考。
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